人間充質(zhì)干細胞成脂分化調(diào)控機制的研究

單志強 許西 郭文婕

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于發(fā)育早期中胚層干細胞，具有干細胞的特性，來源廣泛，是開展干細胞移植、工程技術(shù)的理想種子細胞[1-2]。人MSCs成脂分化技術(shù)有成為人體軟組織修復(fù)技術(shù)，但MSCs的分化受到多種因素的影響，有關(guān)于調(diào)控機制的研究較少[3]。本文嘗試就此進行探。

1 材料方法

1.1 實驗材料

從健康骨髓捐獻骨髓中獲得5～10 ml樣本，采用傳統(tǒng)的人淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲得骨髓單個核細胞。

1.2 儀器與試劑

試劑：DNA提取試劑盒，PCR鑒定引物，DMEM/F-12完全培養(yǎng)液，平衡鹽溶液PBS，胎牛血清、MTT試劑盒、雙抗等。儀器主要包括酶標儀、水浴鍋、低溫高速離心機、倒置顯微鏡照相系統(tǒng)、PCR儀、超凈工作臺、CO2細胞培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、普通離心機、超低溫冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)、鑒定 將獲得的骨髓單個和西北，采用原代培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，導(dǎo)致顯微鏡評估原代BM-MSCc貼壁生長情況，結(jié)果顯示貼壁良好，呈放射狀克隆性生長。而獲進行穿戴培養(yǎng)、擴增，獲得第一代細胞計為P1，而后繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞生長到80%～90%融合，繼續(xù)采用消化離心穿戴培養(yǎng)法培養(yǎng)，依次將第2-n代細胞記作P2、P3、P4……，Pn代細胞。將獲得的各代細胞，1 200 rpm/5 min，室溫下離心，棄上清，采用DMSO凍存液重懸細胞沉淀，調(diào)整濃度為2.4×106/ml，每個凍存管1.5 ml懸液分裝，4 ℃冰箱保存30 min，而后-20 ℃凍存1 h，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱放置過夜，次日液氮罐保存，在1個月內(nèi)使用。使用前，進行復(fù)蘇，以供使用。使用前，進行BM-MScs表面分子標志檢測，采用藻紅蛋白（PE）標記小鼠抗人單克隆抗體CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、CD34、CD31，異硫氰酸熒光素標記小鼠抗人單克隆抗體GAPD標記，同時分別采用相應(yīng)PE-小鼠抗人IgG1、FITC-小鼠抗人IgG1作為同型對照抗體。

1.3.2 成脂分化能力與基因表達鑒定 （1）誘導(dǎo)BM-MSCs向脂肪細胞分化：①消化、離心收集P4-P6代BM-MSCs，采用4×104孔接種細胞，培養(yǎng)24 h，代細胞貼壁，棄培養(yǎng)液；②每孔加入2 ml成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3日，換液1次，持續(xù)14日；③完畢后棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗洛細胞2次，4%甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗滌細胞3次；④每孔加入0.2%油紅O染色1～2 m，37℃染色孵育30 min，吸去染液，PBS緩沖液洗滌細胞3次；⑤導(dǎo)致顯微鏡檢查。

（2）成脂細胞特異性基因RT-PCR檢測：對照組、成脂分化實驗組各個時間點，采用75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)后獲得細胞層，加入500 μl蛋白質(zhì)裂解液，冰上裂解，期間晃動培養(yǎng)瓶，保證裂解液覆蓋在每一個角落，裂解完后，細胞刮刀刮下破碎的細胞懸液，轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，13 200 rpm，4 ℃離心20 min，轉(zhuǎn)入上清到EP管，沸水浴5 min使蛋白變性，冷卻后離心，轉(zhuǎn)移到新的EP管，分出100 μl定量，其余-70℃保存，收集蛋白質(zhì)。采用Real-Time PCR驗證質(zhì)譜分析，以差異蛋白組學(xué)分析得到的脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為檢測對象，利用NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，設(shè)計這些蛋白質(zhì)的基因R-t PCR反應(yīng)引物。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)、傳代情況

分離培養(yǎng)得到的間充質(zhì)干細胞，倒置顯微鏡觀察顯示如下，接種后可間少量形態(tài)各異的細胞貼于培養(yǎng)瓶底部，梭型、多角形不規(guī)則散在分布，培養(yǎng)5～7日后，貼壁成克隆性生長，14～21日細胞密度達到80%～90%融合，細胞排列整齊，細胞形態(tài)逐漸均一，成長梭型。見圖1 A～D。

圖1 間充質(zhì)細胞-原代細胞培養(yǎng)各個時間表現(xiàn)情況

2.2 表面標記免疫熒光檢測

表面標記免疫熒光檢測結(jié)果如下，P3、P9、P16代的間充質(zhì)干細胞CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH表達不存在顯著差異，在進行傳代培養(yǎng)后，維持比較穩(wěn)定的免疫表型標志物表達譜。從上到下分別為CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH免疫表現(xiàn)，從左邊到有分別為第P3、P9、P16代細胞，見圖2。

2.3 向脂肪細胞誘導(dǎo)分化后的油紅O染色鏡下表現(xiàn)

誘導(dǎo)前5天，細胞形態(tài)沒有明顯變化。誘導(dǎo)第7天，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，形態(tài)學(xué)觀察顯示，誘導(dǎo)后的細胞體積增大，少部分細胞胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)小脂滴。誘導(dǎo)10天后，含脂滴的細胞數(shù)量明顯增加，隨著細胞誘導(dǎo)時間的進行，小的脂滴匯合形成大的脂滴。在高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)14天后含有脂滴的細胞數(shù)量比例明顯增多。未加成脂誘導(dǎo)劑的對照組細胞形態(tài)始終沒有明顯變化，細胞內(nèi)也沒有脂滴出現(xiàn)。分別取實驗組和對照組誘導(dǎo)后第5天、10天、14天的細胞進行油紅O染色，可見實驗組第7天開始細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴并被染成紅色，而且脂滴數(shù)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加而增加并由小的脂滴逐漸聚集成大的脂滴。而對照組細胞油紅O染色均呈陰性。

圖2 表面標記免疫熒光檢測結(jié)果

2.4 脂肪細胞特異性基因檢測

脂肪細胞特異性基因RT-PCT檢測結(jié)果如下，相較于對照組，實驗組第7天、10天、14天的LPL、PPAR-γ基因表達高于對照組（無表達），同時隨著時間的延長，表達信號強度明顯逐漸上升，提示間充質(zhì)干細胞成脂化與LPL、PPAR-γ基因表達有關(guān)，見圖3。

圖3 脂肪細胞特異性基因RT-PCR檢測

3 討論

LDL即脂蛋白脂肪酶基因，其中內(nèi)含子6中PVU Ⅱ多態(tài)位點和內(nèi)含子8中HindⅢ多態(tài)位點與高脂血癥有關(guān)，并為高脂血癥的家系連鎖分析提供了遺傳標記，增加CM殘粒結(jié)合到LPL受體的能力[4-5]。本次研究顯示，人間充質(zhì)干細胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達增強有關(guān)，特別是在第7日達到脂分化高峰，在第10日仍然呈現(xiàn)持續(xù)脂分化。提示PPARs控制許多細胞內(nèi)的代謝過程，是重要的細胞分化轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物脂肪組織中呈現(xiàn)高表達[6-7]。在敲除PPAR-γ基因試驗中，小鼠往往會在胚胎期死亡，體現(xiàn)PPAR-γ基因的重要性[8]。PPAR-γ基因與脂代謝過程中的多種基因如脂肪酸吸收（LPL）、脂類運輸（Fabp4）等關(guān)系密切，通過調(diào)節(jié)脂肪因子表達，從而參與成脂化[9]。

需要注意的是，本文中采用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)成脂化，而充間質(zhì)干細胞的分化影響因素較多，其他成脂分化的具體機制有待進一步研究[10]。除以上特異性基因外，還存在其他許多脂肪因子基因，有鑒于成脂化的復(fù)雜機制，需要開展更多的基因分析，以構(gòu)建基因表達網(wǎng)絡(luò)，為成脂化調(diào)控提供理論基礎(chǔ)[11-12]。由此可見，人間充質(zhì)干細胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達增強有關(guān)。

綜上所述，人間充質(zhì)干細胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達增強有關(guān)。