金鈴子散的半仿生提取及抗癌活性研究

戴　一，艾甜碧

?

金鈴子散的半仿生提取及抗癌活性研究

*戴一，艾甜碧

（安徽新華學院藥學院，安徽，合肥 230088）

研究金鈴子散的半仿生提取及抗癌活性。將金鈴子散進行半仿生提取，提取物通過MTT法研究其抗癌活性。金鈴子散用含20%乙醇的半仿生液提取效果較佳，且抗癌活性較好，尤其對人肝癌 HepG2 細胞具有抗癌活性。金鈴子散半仿生提取物均表現(xiàn)出一定的抗癌活性，為其臨床抗癌應用提供科學依據(jù)。

金鈴子散；半仿生提??；抗癌活性

金鈴子散出自《素問·病機氣宜保命集》，由延胡索、川楝子兩味藥1:1比例配伍組成。該方以延胡索活血行氣，川楝子泄肝火、疏肝行氣，二藥相配，一溫一寒，一血一氣，配伍后能活血散淤、行氣鎮(zhèn)痛，為治療胸痛、脘腹疼痛的常用藥方[1]。因此，鎮(zhèn)痛抗炎是金鈴子散前期研究的重點[2-3]。當今金鈴子散臨床上也用于癌癥的治療，且取得了積極的效果[4]，與其組方藥材功效吻合。川楝子又名金鈴子，為楝科植物川楝Sieb et Zucc 的干燥成熟果實，文獻報道川楝子所含的檸檬苦素類三萜具有較強抗癌活性，如川楝素可通過多種途徑抑制腫瘤細胞生長[5-6]。延胡索（W. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu），又名玄胡索、元胡等，為罌粟科、紫堇屬草本植物，主要含生物堿類活性成分，如延胡索乙素、小檗堿等，亦具有較強的抗癌活性[7-8]。金鈴子散常以酒服用，但酒精度未有明確的考察及記載，同時金鈴子散含有生物堿，提取溶劑的酸堿性對其成分溶出具有一定影響，且金鈴子散服用過程需通過胃腸的酸堿環(huán)境。鑒于以上兩方面原因，本實驗以不同濃度乙醇半仿生液對金鈴子散進行半仿生提取，即在不同濃度乙醇存在條件下，簡單模擬胃液酸性環(huán)境及腸液堿性環(huán)境在37℃溫度振搖提取，并對提取物進行抗癌活性研究，為金鈴子散的抗癌臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SHZ-88水浴恒溫振蕩器（常州市國立試驗設備研究所）；酶標儀（美國安捷倫科技公司）； FA2004型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；8510E-DTH超聲提取器（美國必能信公司）；旋轉蒸發(fā)器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)；DZF-6020型真空干燥箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）。

1.2 試劑與材料

延胡索、川楝子（購置于亳州藥材市場，產(chǎn)地湖北，經(jīng)安徽新華學院慶兆老師鑒定）；DEME培養(yǎng)基（hyclone公司，批號：AC10220185）；MTT（碧云天公司）；其他試劑均為分析純。材料：人宮頸癌HeLa細胞及人肝癌HepG2細胞來自于美國菌種保藏中心即ATCC公司（美國）。

2 方法

2.1 半仿生溶液的配制

以磷酸鹽緩沖液配制配制0、20%、40%、60%濃度的乙醇溶液，每種濃度乙醇液分別調(diào)pH值制成pH=2和pH=10的溶液各一份，共得8份半仿生溶液，即：磷酸鹽緩沖液（pH=2）、磷酸鹽緩沖液（pH=10）、20%乙醇磷酸鹽緩沖液（pH=2）、20%乙醇磷酸鹽緩沖液（pH=10）、40%乙醇磷酸鹽緩沖液（pH=2）、40%乙醇磷酸鹽緩沖液（pH=10）、60%乙醇磷酸鹽緩沖液（pH=2）、60%乙醇磷酸鹽緩沖液（pH=10），備用。

2.2 金鈴子散的半仿生提取[9]

稱取金鈴子散4份，每份5 g，每份用pH=2和10的同種半仿生溶液先后提取，固液比1 g：10 mL，提取溫度37 ℃，搖床上震搖30 min，提取液合并，濃縮至干，稱重，計算浸膏得率。

2.3 MTT實驗[10]

MTT實驗主要使用人宮頸癌HeLa 細胞株、人肝癌 HepG2 細胞株。取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，以0.25％胰蛋白酶消化后，用DEME培養(yǎng)液稀釋懸浮，接種于96孔板，每孔加入100 μL，5000個細胞。常規(guī)培養(yǎng)12 h后，試驗組每孔加入適量不同濃度（6個濃度）的金鈴子散半仿生提取物，每個濃度設3個復孔，同時設陰性對照組。培養(yǎng)48 h后，每孔加入15 μLMTT生理鹽水溶液（5 g·L-1），繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL的DMSO，于酶標儀上測定波長490 nｍ時的吸光度。計算細胞增殖抑制率：抑制率（％）＝（１-實驗組吸光度／對照組吸光度）×100％。并根據(jù)各濃度的抑制率，采用LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3 結果與討論

3.1 金鈴子散的半仿生提取得膏率

半仿生提取是通過模擬胃腸道環(huán)境研究口服藥物在胃腸中轉運而設計的一種提取方法，以期盡可能保留原藥中的有效成分，不同于西藥中的天然產(chǎn)物開發(fā)模式，符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)的整體觀、系統(tǒng)觀，體現(xiàn)了中藥多成分復合作用的特點[11]。金鈴子散分別用不同半仿生溶液提取后，能較好地保留復方中的成分。通過半仿生提取，金鈴子散各提取組得膏率見表1，可見隨著乙醇濃度的升高，提取率略有降低，但幅度不大。鑒于半仿生溶液總體乙醇濃度都不太高，說明金鈴子散的半仿生提取物以極性較大成分為主，與文獻報道延胡索主要含生物堿，川楝子中主要含多氧原子萜類成分吻合，這些化學成分的極性適合于低濃度的乙醇提取。所得干浸膏用于抗癌活性實驗，鑒于提取物為混合物，濃度以mg/L表示。

表1 金鈴子散半仿生提物得膏率

3.2 金鈴子散的半仿生提取物MTT活性實驗

MTT法以其快速、簡單的操作，廣泛用于藥物的篩選。對金鈴子散進行半仿生提取物進行MTT抗癌活性實驗，結果見圖1。對HepG2細胞，四種半仿生溶液（即分別由純磷酸緩沖液、20%乙醇磷酸鹽緩沖液、40%乙醇磷酸鹽緩沖液和60%乙醇磷酸緩鹽沖液配制的半仿生提取液）提取物IC50值分別為88.20、32.02、47.23、105.50 mg/L。從IC50值來看，含20%乙醇的半仿生溶液提取物活性最好，其次為含40%乙醇的半仿生溶液提取物，最差的為含60%乙醇的半仿生溶液提取物；對HeLa細胞，四種半仿生溶液（即分別由純磷酸緩沖液、20%乙醇磷酸鹽緩沖液、40%乙醇磷酸鹽緩沖液和60%乙醇磷酸緩鹽沖液配制的半仿生提取液）提取物IC50值分別為72.26、67.58、194.90、128.95 mg/L。從IC50值來看，含20%乙醇的半仿生溶液提取物活性與不含乙醇的半仿生溶液提取物活性差別不大，但均強于另外兩種半仿生溶液提取物?？梢?，金鈴子散半仿生提取物對HeLa細胞、HepG2細胞均表現(xiàn)出一定的抗癌活性。在兩株細胞中，且含20%乙醇的半仿生溶液所提取出的產(chǎn)物，活性均好于其他半仿生溶液所得的提取物，尤其是在人肝癌 HepG2 細胞中表現(xiàn)尤為明顯。

金鈴子散主要由延胡索及川楝子組成，所含成分主要為生物堿及含氧較多的三萜，極性較大。本次實驗采用的半仿生提取，較貼近藥物在體內(nèi)的吸收過程，經(jīng)歷了酸堿環(huán)境，對于酸性及堿性成分的提取具有針對性；同時，又搭配一定的乙醇，有利于化學成分的溶出，比較適合延胡索中的生物堿成分及川楝子中的含氧萜類成分的提取。可見，低濃度乙醇有助于金鈴子散抗癌活性成分的溶出，與金鈴子散文獻記載用酒服用有一定吻合，是金鈴子散抗癌活性成分提取的較佳選擇。另外，從60%乙醇半仿生液提取物表現(xiàn)出來的結果也印證了這一結論。實驗結果表明20%乙醇半仿生液提取物抗癌活性較佳，說明金鈴子散以酒送服有一定依據(jù)，且酒精度不宜太高，也符合古代釀酒酒精度不高的實際。

圖1 金鈴子散半仿生提取物MTT實驗結果

4 小結

金鈴子散為延胡索與川楝子以1：1的配比組成的經(jīng)典名方，在臨床鎮(zhèn)痛抗炎中發(fā)揮了重要的作用，近年來從兩味組方藥材中分離出了許多抗癌成分，為金鈴子散的臨床擴展應用提供了依據(jù)。作為抗癌方劑，金鈴子散主要用于治療食管癌[6]。但其具體的藥理作用物質(zhì)基礎不明，未見文獻報道。本實驗結合金鈴子散以酒送服的給藥方式，采用半仿生法提取金鈴子散，對提取物進行細胞毒性試驗，結果顯示，金鈴子散的提取物確實具有一定的抗癌活性，為金鈴子散的合理提取提供了依據(jù)，即低濃度20%乙醇半仿生提取。提取物表現(xiàn)出的抗癌活性為金鈴子散的抗癌活性進一步研究提供了依據(jù)。由于提取物包含成分復雜，具體發(fā)揮抗癌的活性成分有待進一步研究，也是金鈴子散今后抗癌活性研究的重要方向。

[1] 王緒前. 金鈴子散使用沿革[J].湖北中醫(yī)學院學報，1993,1(1):25-26.

[2] 朱愛江,方步武,吳咸中,等. 金鈴子散的抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床,2008,24 (3) :1-3.

[3] 戴一,賈曉益,王海菲. 金鈴子散抗炎有效部位篩選及質(zhì)譜表征[J].井岡山大學學報:自然科學版,2015, 36(1):103-106.

[4] 曹志成,劉潔華. 癌中西醫(yī)面面觀[M].上海:上?？茖W技術出版社,2009:247.

[5] Ju J, Qi Z, Cai X, et al. Toosendanin induces apoptosis through suppression of jnk signaling pathway in hl-60 cells[J]. Toxicol In Vitro, 2013, 27(1):232-238.

[6] Wang G, Feng C C, Chu S J, et al. Toosendanin inhibits growth and induces apoptosis in colorectal cancer cells through suppression of akt/gsk-3beta/beta-catenin pathway[J]. Int J Oncol, 2015,47(5):1767-1774.

[7] Zhao Y,Gao J L,Ji J W, et al. Cytotoxicity enhancement in mda-mb-231 cells by the combination treatment of tetrahydropalmatine and berberine derived from corydalis yanhusuo w. T. Wang[J]. J Intercult Ethnopharmacol, 2014,3(2): 68-72.

[8] Shi J,Zhang X,Ma Z,et al. Characterization of aromatase binding agents from the dichloromethane extract of corydalis yanhusuo using ultrafiltration and liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Molecules, 2010, 15(5):3556-3566.

[9] 張藜莉. 均勻設計法優(yōu)選二妙丸方藥的半仿生提取工藝[J]. 中國中藥雜志,2012,37 (16) :2396-2399.

[10] Aryal S, Hu C M J, Zhang L F. Polymer-cisplatin conjugate nanoparticles for acid-responsive drug delivery [J].ACS nano,2010,4(1):251-258.

[11] 楊茉,周晶. 半仿生技術在復方中藥提取中的應用進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19 (8) :1946-1947.

SEMI-BIONIC EXTRACTION AND ANTICANCER ACTIVITY OF JINLINGZI SAN

*DAI Yi, AI Tian-bi

(School of Pharmaceutical Sciences, Anhui Xinhua College, Hefei, Anhui 230088, China)

: To explore semi-bionic extraction and anticancer activity of Jilingzi San.: Jinlingzi San was extracted by semi-bionic extraction and the extracts were assayed by MTT to study the anticancer activity.: Jinlingzi San could be extracted well by solution of semi-bionic extraction containing 20% ethanol to get the best active fraction against cancer cell, especially HepG2 cell.: Semi-bionic extraction of Jilingzi San had anticancer activity, which provided the reference for clinical application.

Jinlingzi San; semi-bionic extraction; anticancer activity

1674-8085(2018)03-0098-04

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.03.020

2018-01-02；

2018-03-02

安徽省教育廳自然科學研究重點項目(KJ2016A301); 國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃創(chuàng)新 (201412216005)

*戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物結構修飾及化學藥物合成研究(E-mail:daiyiii@163.com);

艾甜碧(1993-)，女，安徽安慶人，安徽新華學院藥學院制藥工程專業(yè)2012級本科生(E-mail:1874182952@qq.com).