基于主成分分析和聚類分析評價安徽省地產(chǎn)及全國主產(chǎn)區(qū)藥材半夏質(zhì)量

劉　宏，戴　勝，秦亞東

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基于主成分分析和聚類分析評價安徽省地產(chǎn)及全國主產(chǎn)區(qū)藥材半夏質(zhì)量

*劉宏，戴勝，秦亞東

（安徽省中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽，蕪湖 241000）

目的 綜合分析、比較、評價皖產(chǎn)半夏和全國主產(chǎn)區(qū)半夏質(zhì)量。方法 比色法、電位滴定法測定安徽及全國主產(chǎn)區(qū)半夏氨基酸、有機(jī)酸、多糖、蛋白質(zhì)及生物堿含量，并通過聚類分析和主成分分析對半夏質(zhì)量進(jìn)行評價。結(jié)果 不同產(chǎn)地半夏藥材5類成分含量差異較大。結(jié)論主成分分析和聚類分析適用于半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量特征評價。

半夏；質(zhì)量；安徽??；聚類分析

半夏為天南星科植物半夏.的塊莖，為2015年版《中國藥典（一部）》收錄的唯一正品半夏藥材。其性溫，味辛，有小毒，歸脾、胃、肺經(jīng)。具有降逆止嘔、燥濕化痰、和胃安神、寬中消痞、排膿消癰作用[1]?，F(xiàn)代中藥藥理研究表明，半夏具有鎮(zhèn)咳、催吐和鎮(zhèn)吐、抗癌、調(diào)節(jié)胃腸功能及利膽等作用。半夏塊莖含75％左右的淀粉，β-谷甾醇及其葡萄糖苷，L-麻黃堿、膽堿、胡蘆巴堿、多糖、多種氨基酸及無機(jī)元素。其藥理作用主要表現(xiàn)在抗腫瘤、抗炎、祛痰鎮(zhèn)咳、抗?jié)冏饔?，另外對循環(huán)系統(tǒng)也有抑制作用[2]。

野生半夏主產(chǎn)于山東、安徽、湖南、江蘇、浙江等省。我省的半夏歷來質(zhì)量上乘，如阜南、穎上所產(chǎn)的半夏，譽(yù)稱之“穎半夏”，貴池殷匯所產(chǎn)半夏，譽(yù)稱之“匯半夏”，舒城所產(chǎn)半夏，譽(yù)稱之“舒半夏”，均著名于世。特別是阜南焦坡集的半夏，譽(yù)稱之“焦半夏”，歷史上曾為朝廷進(jìn)貢珍品，其個大色白，粉足重實，一面凹入，白色，棕眼明顯，另一面半球形，美稱之為“圓珠半夏”[3]?，F(xiàn)今安徽市場上銷售半夏基本為外省所產(chǎn)，故為了解安徽地產(chǎn)半夏質(zhì)量優(yōu)劣，尋找優(yōu)質(zhì)半夏種質(zhì)資源，為我省大范圍發(fā)展半夏人工種植提供科學(xué)的依據(jù)。

《中國藥典（一部）》2015版中規(guī)定半夏藥材總酸含量不低于0.25%，僅以總酸含量難以客觀全面反映半夏藥材的內(nèi)在質(zhì)量差異。為更全面反映半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量特征，本研究采集了安徽具有代表性的三個產(chǎn)地及五個外省半夏主產(chǎn)區(qū)標(biāo)本，每個產(chǎn)地采樣兩批標(biāo)本進(jìn)行研究，以不同來源半夏藥材氨基酸等五類成分含量為變量，利用主成分分析的數(shù)據(jù)降維思維和聚類分析將變量根據(jù)相似性而分類的方法來概括五類成分含量信息，在整體上區(qū)分或分類不同產(chǎn)地、不同來源半夏藥材，更全面評價安徽產(chǎn)半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1　儀器

XMTD-4000數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京光明醫(yī)療儀器有限公司）；85-2數(shù)字恒溫磁力攪拌器（北京光明醫(yī)療儀器有限公司）；XC-XY-320型超聲波提取器（河北星聯(lián)晨科技有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Discovery十萬分之一電子天平（美國OHAUS）；3-18k離心機(jī)（德國SIGMA有限公司）；Cary-60紫外分光光度計（Agilent Technologies）；PHS-3C酸度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超純水處理系統(tǒng)（北京萊特萊德純水設(shè)備技術(shù)股份有限公司）。

1.2 材料

半夏藥材由安徽省中醫(yī)藥高等專科學(xué)校趙寶林教授鑒定為天南星科植物三葉半夏（Thunb.）Breit. 的干燥塊莖。本省藥材均由作者自行采集，外省藥材由浙江省醫(yī)藥公司和亳州藥材市場提供。D(+)-無水葡萄糖（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：170224）；牛血清蛋白（山西西亞化學(xué)有限公司，批號：N02038）；纈氨酸（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：170530）；鹽酸麻黃堿（中國食品藥品檢定研究院，批號：171241-201508）；其余所用試劑均為分析純，水為純化水。

2 各類成分測定方法

2.1 多糖

2.1.1 對照溶液制備

精密稱量干燥至恒重的D(+)-無水葡萄糖10.59 mg，純化水溶解并定容至100 mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別取對照溶液0.1、0.25、0.4、0.55、0.7、0.85、1.0 mL至具塞試管中，加水補(bǔ)足至1.0 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，100℃水浴15 min，取出后迅速冰水浴15 min，放冷至室溫，另取水1.0 mL同法制備參比溶液[4]。

取上述待測溶液1份，在400~800 nm波長下掃描，確定λmax= 490 nm，此波長下測定上述溶液得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = 0.0088x+0.0034（R2= 0.9995，濃度單位：μg/mL）。

2.1.3 樣品溶液制備

半夏粉碎，過80目篩，80 ℃干燥2 h，精密稱定1.0 g，50 mL水80 ℃浸提2 h，共3次，合并濾液，濃縮并定容至50 mL。取2 mL至15 mL離心管中，加無水乙醇10 mL，冷藏24 h，4000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀用80 %乙醇洗滌兩次，每次8 mL，離心棄去，沉淀再用80 ℃水溶解，定容于100 mL容量瓶[5]，即得。

2.1.4 測定方法

取上述樣品溶液1份，按照單因素實驗確定加樣量為0.5 mL，取各產(chǎn)地待測液0.5 mL，照2.1.1項下的方法測定吸光度，計算多糖含量。

2.2 有機(jī)酸

2.2.1 測定方法

取2.1.3項下處理的半夏粉末約5 g，精密稱重，加95%乙醇50 mL，回流提取1 h，同法再提取2次，濾液合并，回收乙醇。殘渣精密加入NaOH滴定液（0.1 mol/L）10 mL，超聲（功率500W，頻率40KHz）30 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用新沸過的冷水定容，精密量取25 mL，照2015版《中國藥典》附錄ⅧA法測定，用HCl滴定液（0.1 mol/L）滴定，水為空白試劑做校正[6]，記錄數(shù)據(jù)，計算滴定液體積，每1 mLNaOH相當(dāng)于琥珀酸5.904 mg。滴定液體積計算公式如下：

Ve：電位滴定計量點體積；V1，V2：所選兩點消耗滴定液體積；△E：兩點電位差；S：電極響應(yīng)斜率

2.2.2 穩(wěn)定性測定

取同一產(chǎn)地半夏生品，依上述方法，間隔2 h測定一次，共6次。結(jié)果表明，供試液在10 h內(nèi)，總有機(jī)酸含量穩(wěn)定（RSD = 2.02%）。

2.2.3 重復(fù)性測定

取兩個產(chǎn)地半夏生品，分別制取6份樣品溶液，依上述方法測定，RSD分別為2.96%和2.35%，表明方法重復(fù)性好。

2.3 蛋白質(zhì)

2.3.1 對照溶液制備

精密稱取牛血清蛋白10.1 mg，純化水定容至100 mL，4℃保存待用。

2.3.2 考馬斯亮藍(lán)G250溶液配制

精密稱取60 mg考馬斯亮藍(lán)G250，用95%乙醇50 mL溶解，加入85%H3PO4于1L棕色容量瓶中定容，即得[7]。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取上述對照溶液0.1、0.25、0.4、0.55、0.7、0.85、1.0 mL至具塞試管中，加水補(bǔ)足至1.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液4.0 mL，混勻，5 min后進(jìn)行波長掃描，確定λmax= 595 nm，在此波長條件下測定各對照溶液吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 0.003x+0.0389（R2= 0.9931，濃度單位：μg/mL）。

2.3.4 樣品溶液制備

精密稱取2.1.3項下半夏粉末0.75 g，研缽中加1%NaOH溶液10 mL，研磨成勻漿，用1%NaOH溶液定容至50 mL，超聲30 min，加水補(bǔ)足至50 mL。取10 mL在5000 r/min條件下離心20 min，上清液即為供試溶液[8]。

2.3.5 測定方法

取樣品溶液各0.1 mL，加純化水補(bǔ)足至1.0 mL，依2.3.3項下方法測定吸光度，計算，即得。

2.4 氨基酸

2.4.1 對照溶液制備

精密稱取纈氨酸12.9 mg，純化水定容至100 mL。

2.4.2 緩沖溶液制備

取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL及0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，用水定容至1.0 L，即得。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取上述對照溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL至25 mL容量瓶，加0.2%茚三酮溶液及上述緩沖溶液各1.0 mL，沸水浴加熱15 min，后室溫下冷卻15 min，加水至刻度。進(jìn)行波長掃描，確定λmax= 569 nm，在此波長條件下測定各對照溶液吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 0.0083x+0.0014（R2= 0.9984，濃度單位：μg/mL）。

2.4.4 樣品溶液制備

精密稱取2.1.3項下半夏粉末1.0 g，加50 %乙醇50 mL，超聲30 min，過濾，重復(fù)2次，提取液合并，回收乙醇，于50 mL容量瓶中加水定容[10]。

2.4.5 測定方法

取樣品溶液各1.5 mL，依2.4.3項下方法測定吸光度，計算，即得。

2.5 生物堿

2.5.1 麝香草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液的制備

精密稱取麝香草酚藍(lán)0.1 g，加0.05 mol/L氫氧化鈉3.2 mL溶解，加水稀釋至200 mL。

2.5.2 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的制備

量取0.1 mol/L檸檬酸38 mL及0.1 mol/L檸檬酸鈉162 mL，混合后定容至1.0 L。

2.5.3 對照溶液制備

精密稱取鹽酸麻黃堿5.1 mg，純化水定容至50 mL。取1.0、2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10.0 mL于分液漏斗中，加水至10 mL，加20 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH = 6.0），20 mL三氯甲烷，2.5 mL麝香草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液，振搖萃取，靜止30 min，分取三氯甲烷層，同法三氯甲烷再萃取2次，合并三氯甲烷液，濃縮并定容至25 mL[11]。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取上述對照溶液，在300~500 nm進(jìn)行波長掃描，確定λmax= 417 nm，此波長下測定上述溶液得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = 0.0081x-0.012（R2= 0.9974，濃度單位：μg/mL）。

2.5.5 樣品溶液制備

精密稱取2.1.3項下半夏粉末1.0 g，加入1.0 mL濃氨水浸潤藥材，加入三氯甲烷20 mL，浸漬過夜后超聲提取30 min，過濾，藥渣用20 mL三氯甲烷分3次洗滌，合并，蒸干溶劑，殘渣再加20 mL三氯甲烷使其溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗，依據(jù)2.4.3項下的方法制備樣品溶液[12]。

2.5.6 測定方法

對上述樣品溶液在波長417 nm下測定吸光度，計算生物堿含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 半夏中五類有效成分的測定結(jié)果

安徽及全國主產(chǎn)區(qū)半夏每個產(chǎn)地兩批，共16批，測定各類成分含量，列表如下。

表1 安徽及全國主產(chǎn)區(qū)半夏各類成分含量

3.2 半夏藥材質(zhì)量分析

3.2.1 主成分分析

將16批半夏藥材多糖、有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿含量數(shù)據(jù)錄入EXCEL，導(dǎo)入SIMCA-P (11.5版)軟件，以半夏5種成分的含量為變量進(jìn)行二維主成分分析，結(jié)果見圖１所示。

圖1 半夏5種成分PCA分析1.M1(PCA-X) t[Comp.1]/t[Comp.2]

由圖1可見，16批半夏樣品區(qū)分明顯，樣品S1、S2位于第一主成分負(fù)值象限，S9、S10位于第一主成分和第二主成分正值象限區(qū)域，其余樣品則分布在第一主成分和第二主成分正負(fù)值區(qū)域。由表1可以看出，樣品S9、S10偏離其他樣品較遠(yuǎn)，與多糖含量明顯偏高、氨基酸和生物堿含量明顯偏低有關(guān)；樣品S1、S2偏離其他樣品，與多糖含量明顯偏低、蛋白質(zhì)和氨基酸含量明顯偏高有關(guān)。

繼續(xù)深入分析，發(fā)現(xiàn)縮小象限范圍S11、S12位于第一主成分[-1~0]與第二主成分[-1.5~2]象限區(qū)域，偏離S3、S4、S5、S6、S7、S8、S13、S14、S15、S16所處的第一主成分[-1~1]與第二主成分[1.5~2]象限區(qū)域，尤其是在第二主成分象限范圍區(qū)分明顯，與其蛋白質(zhì)含量偏高有關(guān)系。若按產(chǎn)地分析，不同產(chǎn)地半夏藥材未能有效區(qū)分，因此若以5類成分總含量為數(shù)據(jù)源，半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量與產(chǎn)地可能關(guān)聯(lián)度不強(qiáng)，其原因可能是在樣品采集時間、處理方式等方面因素未能考慮。

3.2.2 聚類分析

為近一步分析16批不同產(chǎn)地半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量彼此疏遠(yuǎn)關(guān)系、進(jìn)一步驗證主成分分析結(jié)果，以16批半夏樣品5類成分含量為變量，EXCEL數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin（8.0版）軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理、選擇歐式距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2所示。

圖2 半夏5種成分聚類分析

由圖2聚類分析結(jié)果可見：16批不同產(chǎn)地半夏樣品在歐式距離約1.25附近時被分為Ⅰ、Ⅱ大類，S9、S10被單獨(dú)聚為Ⅱ大類，其余樣品聚為Ⅰ大類，反映出S9、S10號樣品明顯偏離其他樣品，與圖1主成分分析結(jié)果保持一致；繼續(xù)縮小歐式距離在1附近時，16批半夏藥材被聚為A、B、C三類，Ⅰ大類又被分為A、B兩大類，A類包含S1、S2號半夏樣品，B類包括S3、S4、S5、S6、S7、S8、S13、S14、S15、S16號樣品，C類包括S9、S10，結(jié)果與主成分分析保持一致；若繼續(xù)縮小歐式距離B類中S11、S12號半夏藥材被聚集在一起，其結(jié)果與主成分分析保持了高度一致，因此主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果互相驗證，得到很好的解釋，反應(yīng)了不同產(chǎn)地半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量的疏遠(yuǎn)關(guān)系。

4 討論

從表中可以看出各產(chǎn)地半夏總有機(jī)酸和總蛋白含量差異不明顯，作為藥典檢測的指標(biāo)性成分總有機(jī)酸，均符合2015版《中國藥典》“半夏藥材”中所規(guī)定的不低于0.25%。但多糖、氨基酸、生物堿差異較大，特別是作為常見生物活性成分的氨基酸和生物堿的差異較大，顯示各產(chǎn)地半夏質(zhì)量存在顯著差別，特別是生物堿的含量，最低和最高含量差異達(dá)到4倍，故有必要對各產(chǎn)地半夏中所含生物堿的組成及各具體成分含量做進(jìn)一步考察。而皖產(chǎn)半夏中貴池所產(chǎn)野生半夏的總有機(jī)酸、氨基酸及生物堿含量均高于其他產(chǎn)地，蛋白質(zhì)含量也位于前列，作為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源有著極大的開發(fā)前景。

傳統(tǒng)中藥由于所含成分類型多、化學(xué)成分復(fù)雜，且受采收期、炮制加工方法等方面[13]的影響而增加了其質(zhì)量控制難度。隨著分析技術(shù)的日益發(fā)展，從傳統(tǒng)中藥中測定到更多成分的含量信息變得越來越容易，但對于復(fù)雜含量數(shù)據(jù)信息如何進(jìn)行有效分析處理得到藥物研究人員所需信息顯得尤為重要。主成分分析和聚類分析作為化學(xué)識別模式的主要方法，在傳統(tǒng)中藥真假鑒別、種屬產(chǎn)地分類、質(zhì)量控制等領(lǐng)域得到較廣的應(yīng)用。

本研究采用不同分析方法測定半夏藥材中五種類型成分含量，得到不同來源半夏藥材的多變量數(shù)據(jù)，利用主成分分析和聚類分析將不同來源半夏藥材明顯區(qū)分，且兩種分析方法所得結(jié)果互相驗證，很好地解釋了安徽產(chǎn)半夏與其他產(chǎn)地半夏藥材質(zhì)量差異和疏遠(yuǎn)關(guān)系。

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EVALUATION OF THE QUALITY OFIN ANHUI PROVINCE AND OTHER PROVINCES BASED ON PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS AND CLUSTER ANALYSIS

*LIU Hong，DAI Sheng，QIN Ya-dong

（Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Wuhu, Anhui 241000, China）

Objective: To evaluate the quality ofin Anhui Province and the other main production area of China by using comprehensive analysis, comparison and evaluation. Methods: The contents of amino acids, organic acids, polysaccharides, proteins and alkaloids inin Anhui and the other main producing areas of China were determined by colorimetry and potentiometric titration, and the quality ofwas evaluated by cluster analysis and principal component analysis. Results: There are significant differences among the contents of 5 kinds of compounds in different areas. Conclusions：The principal component analysis and cluster analysis are suitable for the evaluation of the internal quality characteristics of.

; quality; Anhui province;cluster analysis

1674-8085(2018)03-0093-05

R284

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.03.019

2018-01-17；

2018-03-22

安徽省教育廳2017年自然科學(xué)計劃項目（KJ2017A684）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃項目（gxyq2017209）

*劉 宏(1975-)，男，安徽蕪湖人，講師，碩士，主要從事中藥化學(xué)研究(E-mail:717079649@qq.com);

戴 勝(1989-)，男，安徽蕪湖人，講師，碩士，主要從事藥物分析化學(xué)研究(E-mail:510348545@qq.com);

秦亞東(1979-)，男，安徽宿州人，副教授，碩士，主要從事中藥質(zhì)量研究(E-mail:393581594@qq.com).