5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法體外抑制斷發(fā)毛癬菌肉芽腫株增殖研究

吳倩倩 石磊 張海艷 張玲琳 高志琴 楊虹 楊連娟 王秀麗，

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院，上海 200443；2.上海市皮膚病醫(yī)院 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200443)

斷發(fā)毛癬菌屬于皮膚癬菌的一種，可引起黑點(diǎn)癬等頭部真菌感染，亦可引起體癬和甲癬，但在某些情況下如局部皮膚屏障破壞，宿主免疫異常時(shí)，斷發(fā)毛癬菌可侵及皮下組織和毛囊，出現(xiàn)深在感染，引起癬菌性肉芽腫[1]。其引起的皮膚深部感染相對(duì)少見，且難以治愈，易復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)治療方法主要是系統(tǒng)性抗真菌藥物口服，但存在治療周期長(zhǎng)、肝腎功能損傷、誘發(fā)耐藥菌產(chǎn)生等缺點(diǎn)。

5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法 (5-aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT)是近年來興起的一種新型抗真菌療法。將ALA外敷于病灶局部，ALA被真菌吸收并轉(zhuǎn)化為大量原卟啉Ⅸ (Protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ)，此時(shí)給予633 nm紅光照射可激活單態(tài)氧等氧毒性物質(zhì)直接殺傷真菌，同時(shí)誘發(fā)免疫反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)揮抗真菌效應(yīng)。國(guó)內(nèi)外已有ALA-PDT成功治療甲癬、花斑糠疹等真菌感染性疾病的報(bào)道，且ALA-PDT對(duì)紅色毛癬菌、白念珠菌的體外抑制作用也已證實(shí)[2-3]。該療法具有起效快，可重復(fù)多次治療，患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)[4]。但目前國(guó)內(nèi)外暫無ALA-PDT對(duì)斷發(fā)毛癬菌的相關(guān)研究，本課題組臨床采用ALA-PDT成功治愈了1例斷發(fā)毛癬菌引起的Majocchi肉芽腫，提示ALA-PDT對(duì)于斷發(fā)毛癬菌肉芽腫株具有殺傷抑制作用，為了進(jìn)一步明確這一作用，本研究首次開展ALA-PDT對(duì)斷發(fā)毛癬菌 (肉芽腫株)的體外抑制研究，評(píng)估ALA-PDT對(duì)斷發(fā)毛癬菌肉芽腫株的直接抑制殺傷能力，為ALA-PDT治療斷發(fā)毛癬菌所致皮膚感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

本研究所用的斷發(fā)毛癬菌菌株分離自臨床1例Majocchi肉芽腫患者頭枕部組織，由本院真菌科分離純化 (見圖1)。ALA粉劑購(gòu)自Sigma公司。PBS緩沖液、RPMI 1640液體培養(yǎng)基、Gibico血清由Gibico公司提供。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SabouraudDextroseAgar，SDA)及馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (Potato Dextrose Agar，PDA)為自制。

1.2 主要儀器

熒光顯微鏡 (德國(guó)蔡司公司)，發(fā)光二極管 (LED)光動(dòng)力治療儀 (武漢亞格光電技術(shù)有限公司)，佳能數(shù)碼相機(jī) (Canon，G16)。

1.3 方法

菌懸液的制備 (1)將真菌培養(yǎng)2周后的菌株在SDA上連續(xù)傳代2次后，得到純化后的菌株。將生長(zhǎng)良好的斷發(fā)毛癬菌菌株用接種鉤分3點(diǎn)接種于PDA上，于28℃溫箱培養(yǎng)7 d活化，加入2 mL生理鹽水，吸管輕輕抽吸，用無菌研磨器研磨使菌絲斷裂，研磨時(shí)用力均勻，雙層紗布過濾后，得到以孢子為主的菌懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用血清含量為5%的RPMI 1640液體培養(yǎng)基調(diào)整含菌量，濃度用菌落形成單位 (Colony-forming units，CFU/mL)表示[5]，使菌懸液的終濃度為 (1～5)×105CFU/mL。(2)ALA溶液的配置：將ALA粉劑稱取12 mg溶于無血清的RPMI 1640液體培養(yǎng)基3 mL中，得到濃度為10 mmol/L的ALA溶液，0.22 μm過濾器過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃冰箱冷藏備用。

熒光物質(zhì)PpⅨ檢測(cè) 將菌懸液與10 mmol/L ALA溶液各1 mL等體積混合，因此ALA終濃度為5 mmol/L，每孔終體積為2 mL，加入六孔板中，錫箔紙覆蓋以避光，放于濕盒內(nèi)，35℃溫箱孵育。同時(shí)設(shè)菌懸液和無ALA溶液的液體培養(yǎng)基各1 mL孵育作為陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別于孵育6 h、孵育6 h照光 (633 nm紅光，40 mW/cm2，200 J/cm2)后即刻、孵育14 d后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)PpⅨ熒光。每孔吸取10 μL混懸培養(yǎng)物加在干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，直接放在熒光顯微鏡下觀察并拍照。熒光顯微鏡設(shè)定激發(fā)波段為540～560 nm，發(fā)射波段為575～640 nm。陰性對(duì)照組于孵育6 h后采用光學(xué)顯微鏡拍照。

增殖研究實(shí)驗(yàn) 共分為4組，所用菌懸液同前，分組為：(1)對(duì)照組，只有菌懸液；(2)單藥組，菌懸液和5 mmol/L ALA溶液避光孵育6 h，無照光；(3)單光組，菌懸液與無ALA的RPMI 1640液體培養(yǎng)基共孵育6 h后633 nm紅光照射，功率密度為40 mW/cm2，能量密度200 J/cm2；(4)ALA-PDT組，菌懸液和5 mmol/L的ALA溶液避光孵育6 h后以功率密度40 mW/cm2，能量密度分別為50，100、150、175、200 J/cm2的633 nm紅光照射。

菌落培養(yǎng)及定量研究 將各組處理后12 h的菌懸液置于渦旋振蕩器上震蕩2 min以便充分混勻，2 500 r/min，5 min離心后，去掉上清，PBS洗兩遍，按梯度稀釋 (1∶10，1∶100，1∶1 000)，移液器各吸取100 μL稀釋后的菌懸液液滴注于SDA平皿，用無菌玻璃棒將其涂布均勻，28℃溫箱培養(yǎng)7 d后，選擇合適的稀釋梯度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，拍攝菌落照片[6]。7 d后計(jì)數(shù)各組菌落數(shù)，以濃度為縱坐標(biāo)，以不同分組為橫坐標(biāo)畫圖。為確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，以上步驟重復(fù)3次。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩分析采用最小顯著性差異t檢驗(yàn)，比較各組之間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功分離斷發(fā)毛癬菌

將培養(yǎng)的菌落經(jīng)2次轉(zhuǎn)種純化后采用液氮研磨法提取DNA，PCR擴(kuò)增，送生工生物 (上海)有限公司測(cè)序。BLAST比對(duì)與DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中斷發(fā)毛癬菌序列同源性達(dá)99%，形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定為斷發(fā)毛癬菌。

2.2 斷發(fā)毛癬菌與ALA孵育熒光檢測(cè)結(jié)果

斷發(fā)毛癬菌與5 mmol/L的ALA孵育6 h后可見磚紅色熒光物質(zhì)PpⅨ產(chǎn)生 (見圖2B)，14 d后隨著真菌增殖，PpⅨ紅色熒光更加明顯 (見圖2C)，ALA-PDT紅光照射后熒光減弱 (見圖2D)。

2.3 增殖研究結(jié)果

光動(dòng)力能量密度為50、100、150 J/cm2時(shí)，菌落生長(zhǎng)幾乎不受影響 (見圖3D、E、F)，菌濃度分別為 (4.87±0.058)×105CFU/mL，(4.77±0.058)×105CFU/mL，(4.63±0.057)×105CFU/mL。當(dāng)光動(dòng)力能量密度為175、200 J/cm2(見圖3G、H)時(shí)，菌落數(shù)量明顯減少，菌濃度分別為 (0.53±0.058)×105CFU/mL，(0.13±0.057)×105CFU/mL，均明顯小于對(duì)照組 (P<0.05)；其他各組低能量密度ALA-PDT組 (PDT-50 J/cm2、PDT-100 J/cm2與PDT-150 J/cm2)、單藥組、單光組 (200 J/cm2)與對(duì)照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (見圖4)，P>0.05。

3 討 論

光動(dòng)力療法殺滅病原微生物主要基于Ⅱ型光動(dòng)力反應(yīng)，局部應(yīng)用光敏劑聯(lián)合特定波長(zhǎng)的光，可以激活光敏劑，使其從基態(tài)到激發(fā)態(tài)，當(dāng)再次回到基態(tài)時(shí)，釋放能量，產(chǎn)生活性氧或其他細(xì)胞毒物質(zhì)[7]。雖然ALA-PDT主要被臨床用于治療光線性角化病、皮膚腫瘤、尖銳濕疣、痤瘡，但近年來它的抗真菌作用亦得到了越來越多的重視[8-9]。國(guó)內(nèi)外研究表明ALA-PDT可有效抑制紅色毛癬菌這一常見皮膚癬菌病致病菌的增殖[2，10]，但目前尚無ALA-PDT對(duì)與紅色毛癬菌同屬親人性的毛癬菌屬-斷發(fā)毛癬菌的相關(guān)研究報(bào)道。

為了進(jìn)一步明確ALA-PDT對(duì)斷發(fā)毛癬菌感染疾病的治療效果，本研究從一例Majocchi肉芽腫患者皮損中分離培養(yǎng)出斷發(fā)毛癬菌肉芽腫株，菌落形態(tài)典型 (見圖1B、C)，并經(jīng)分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)為斷發(fā)毛癬菌。我們以純化后的菌株為研究對(duì)象，用于評(píng)估ALA-PDT對(duì)其的體外殺傷作用。

ALA是光敏劑前體，本身并無熒光，需要在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為PpⅨ后才具有光敏活性，光照后發(fā)揮光動(dòng)力效應(yīng)。未加ALA孵育的對(duì)照組無磚紅色熒光，加入ALA孵育的單藥組菌懸液可見磚紅色熒光，表明斷發(fā)毛癬菌可以特異性吸收ALA，并在線粒體內(nèi)代謝為PpⅨ[10]。本研究使用5 mmol/L的ALA與斷發(fā)毛癬菌孵育6 h時(shí)已有PpⅨ產(chǎn)生，當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，隨著菌絲數(shù)量的增多，PpⅨ的熒光也會(huì)明顯增多 (見圖2C)，說明斷發(fā)毛癬菌吸收ALA轉(zhuǎn)化為PpⅨ能力較強(qiáng)，大部分真菌均可吸收ALA轉(zhuǎn)化為PpⅨ。在避光條件下，過量的PpⅨ在14 d可持續(xù)存在，并不會(huì)隨著自身代謝消退，但是633 nm紅光照射后熒光消退明顯 (見圖2D)，這是因?yàn)檎展鈺r(shí)激活光動(dòng)力效應(yīng)，產(chǎn)生單態(tài)氧的同時(shí)也產(chǎn)生了光漂白現(xiàn)象，所以熒光消退[11]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ALA濃度為5 mmol/L時(shí)，低能量密度照光無法殺傷斷發(fā)毛癬菌，只有照光能量密度高于175 J/cm2時(shí)才觀察到有效的殺傷作用 (見圖3)。光動(dòng)力殺傷真菌與殺傷細(xì)菌相比，需要更高的照光能量密度，這可能與真菌結(jié)構(gòu)有關(guān)[12-13]。真菌具有細(xì)胞壁，且比細(xì)菌體積大，因此需要更高能量的照射。也有部分研究顯示光動(dòng)力殺傷紅色毛癬菌所需照光能量密度低于本研究，如Kamp等[2]研究表明，以10 mmol/L的ALA作為光敏劑，采用10 J/cm2的石英鹵素?zé)粽丈?，可減少50%紅色毛癬菌的生長(zhǎng)。章強(qiáng)強(qiáng)等[14]報(bào)道1例由耐熱型紅色毛癬菌導(dǎo)致的Majocchi肉芽腫，37℃生長(zhǎng)良好，核糖體非轉(zhuǎn)錄區(qū)存在基因序列的變異，這一變種可能具有較強(qiáng)的侵襲力，更容易引起深部真菌病。本研究所使用的斷發(fā)毛癬菌亦來自于可侵襲深部皮膚導(dǎo)致肉芽腫的臨床菌株，體外培養(yǎng)在35℃孵育14 d后菌增殖迅速，需要高能量密度照光方可對(duì)其產(chǎn)生抑制作用，均提示該肉芽腫株亦可能是斷發(fā)毛癬菌的一種同型變種，較斷發(fā)毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株或其他體癬株具有更強(qiáng)的增殖能力，抵抗力更強(qiáng)[15]。

圖1 斷發(fā)毛癬菌致Majocchi肉芽腫患者頭部皮損、斷發(fā)毛癬菌真菌培養(yǎng)、菌落及鏡下結(jié)構(gòu)。A.Majocchi肉芽腫患者頭部皮損；B.分離后的斷發(fā)毛癬菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (右)和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (左)中生長(zhǎng)2周；C.沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皿生長(zhǎng)2周，菌落形態(tài)呈大腦狀，背面為棕紅色；D.小培養(yǎng)鏡下圖：小分生孢子側(cè)生于不規(guī)則的菌絲兩側(cè)，部分小分生孢子膨大呈氣球狀 圖2 熒光物質(zhì)PpⅨ檢測(cè)。A.未加ALA的菌懸液 (陰性對(duì)照組)培養(yǎng)6 h后顯微鏡下觀察×400；B.菌懸液與ALA溶液孵育培養(yǎng)6 h后，熒光顯微鏡下可見磚紅色熒光×400；C.孵育培養(yǎng)14 d后，可見磚紅色熒光更加明顯；D.ALA-PDT紅光照射 (200 J/cm2)后熒光顯微鏡下見磚紅色熒光漸消退 (箭頭處，×400) 圖3 不同處理組對(duì)斷發(fā)毛癬菌體外增殖抑制作用。A.對(duì)照組；B.單藥組 (5 mmol/L ALA)；C.單光組 (200 J/cm2)；D.ALA-PDT組 (50 J/cm2)；E.ALA-PDT組 (100 J/cm2)；F.ALA-PDT組 (150 J/cm2)；G.ALA-PDT組 (175 J/cm2)；H.ALA-PDT組 (200 J/cm2)

Fig.1 Majocchi granuloma on head caused byTrichophytontonsurans. A. Lesions of Majocchi granuloma on head; B.Trichophytontonsuranscolonies on SDA (right) and PDA (left) after 2 weeks culture; C.Trichophytontonsuranscolony on SDA plate after 2 weeks culture, the brain-like colony with reddish brown on the back; D. Small culture: small conidiophores were born on both sides of the irregular mycelium, some small conidia inflated balloon Fig.2 Detection of fluorescent substance PpⅨ. A. Suspension without ALA (negative control group) under a microscope after 6 hours (×400); B. After incubation for 6 hours, the suspension and ALA solution showed brick red fluorescence under fluorescence microscope (×400); C. After incubation for 14 days, the visible brick red fluorescence was more obvious; D. After ALA-PDT irradiations (arrow, ×400), the visible brick red fluorescence was disappeared Fig.3 Theinvitrogrowth inhibition ofTrichophytontonsuransin different treatment groups: A. Control group; B. Single drug group (5 mmol/L ALA); C. Single light group (200 J/cm2); D. ALA-PDT group (150 J/cm2); E. ALA-PDT group (100 J/cm2); F. ALA-PDT group (150 J/cm2); G. ALA-PDT group (175 J/cm2); H. ALA-PDT group (200 J/cm2)

圖4 不同處理組后的斷發(fā)毛癬菌定量分析，"*"表示兩組數(shù)值與對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異 (P<0.05)

Fig.4 Quantitative analysis ofTrichophytontonsuransin different treatment groups. "*" meant significant difference between treatment and control groups (P<0.05)

本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估ALA-PDT對(duì)體外培養(yǎng)的斷發(fā)毛癬菌肉芽腫株活性的抑制效應(yīng)。結(jié)果證實(shí)ALA能夠在真菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化為PpIX，經(jīng)紅光照射后，可產(chǎn)生光動(dòng)力效應(yīng)直接殺傷斷發(fā)毛癬菌肉芽腫株，說明ALA-PDT可用于臨床斷發(fā)毛癬菌感染性疾病的治療。我們擬進(jìn)一步構(gòu)建豚鼠皮膚癬菌感染模型，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入評(píng)估ALA-PDT對(duì)斷發(fā)毛癬菌感染的療效、安全性及作用機(jī)制。