2，4-二氯苯氧乙酸作用的鼠乳對幼鼠藍斑核中多巴胺β-羥化酶表達的影響*

李京，毛慶花，秦燕霞

（1.山東省濟寧醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；2.山東省濟寧市第一人民醫(yī)院 新生兒科，山東 濟寧 272000）

在現(xiàn)代社會，越來越多的環(huán)境污染物嚴重威脅人類的健康。研究顯示[1]，如果女性處于化學污染物不斷增多的工作和生活環(huán)境下，該女性體內(nèi)的化學物質(zhì)將不斷積聚，在其產(chǎn)后的乳汁中，不僅能夠檢測出該化學物質(zhì)，還可能通過哺乳的方式進入新生兒體內(nèi)，導(dǎo)致新生兒自出生后便遭受污染物的損害[1]。

在大鼠出生后的2周內(nèi)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突及樹突呈外向生長，突觸之間聯(lián)系不斷發(fā)生，稱為腦的急劇生長。在發(fā)育過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外環(huán)境的敏感性不斷加強；當外界環(huán)境惡化時，神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)可能表現(xiàn)異常，甚至引起不可逆性損害。多巴胺β-羥化酶（dopamine-beta-hydroxylase,DBH）是催化多巴胺（dopamine）合成去甲腎上腺素（noradrenaline, NA）的標志酶[2]。研究表明，將含有除草劑2, 4-二氯苯氧乙酸（簡稱2, 4-D）的乳汁喂養(yǎng)乳鼠后，發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)改變明顯，在黑質(zhì)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)，多巴胺神經(jīng)元內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的活性降低，5-羥色胺神經(jīng)纖維的密度減少，并伴隨行為活動改變[2]。然而，2, 4-D對于腦內(nèi)去甲腎上腺素遞質(zhì)系統(tǒng)的作用并不清楚。本研究將新生鼠置于2,4-D暴露的環(huán)境中，觀察其藍斑核DBH表達的變化情況，并進一步闡述2, 4-D對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新生Wistar鼠30只及其母鼠購于濟寧醫(yī)學院實驗動物中心（批文號：SCxK晉20080001），兔抗鼠DBH單克隆抗體購于Sigma公司，免疫組織化學（簡稱免疫組化）試劑盒購于北京中杉金橋公司，2，4-D（批號：94-75-7）購于青島捷世康生物科技公司，二甲亞砜（DMSO批號：67-68-5）購于南京化學試劑有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將生后1 d的30只幼鼠分成3組，每組10只，并將相對應(yīng)的母鼠置于同一飼養(yǎng)箱，溫度控制在22～24℃，保持飼養(yǎng)箱衛(wèi)生、通風狀況良好，優(yōu)質(zhì)飲食喂養(yǎng)母鼠，對幼鼠哺乳。自幼鼠生后第8天開始，實驗組1：向母鼠腹腔每天注射2，4-D 70 mg/kg+0.1 ml DMSO；實驗組2：2，4-D 100 mg/kg+0.1 ml DMSO；對照組：母鼠對幼鼠進行哺乳；直至生后第21天，測量幼鼠的體重。第22天處死幼鼠，測量腦重量；取藍斑區(qū)腦組織進行切片、備用。

1.2.2 免疫組化染色 采用試劑盒說明書的步驟，即ABC法進行操作。

1.2.3 相對光密度值測定 采用圖像分析軟件檢測藍斑核DBH陽性區(qū)域的平均灰度值，相對光密度=Log（256/平均灰度）。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

幼鼠生后第22天，與對照組比較，實驗組1體重及腦重減少均不明顯；而實驗組2體重與腦重減少，均低于對照組和實驗1組。見表1。

與對照組比較，兩實驗組幼鼠的藍斑核DBH免疫反應(yīng)降低（見附圖）；實驗組1與實驗組2 DBH相對光密度值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.312）；與對照組比較，實驗組 1（P=0.000）、實驗組 2（P=0.000）DBH相對光密度值均降低（見表2）。

表1 生后第22天，3組幼鼠體重及腦重比較（n =10，±s）

表1 生后第22天，3組幼鼠體重及腦重比較（n =10，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與實驗組1比較，P ＜0.05

組別 體重/g 腦重/g對照組 47.21±2.90 1.33±0.04實驗組1 45.09±3.27 1.31±0.05實驗組 2 35.60±2.841）2） 1.16±0.051）2）F值 42.180 37.863

表2 生后第22天，3組幼鼠藍斑核相對光密度值比較（n =10，±s）

表2 生后第22天，3組幼鼠藍斑核相對光密度值比較（n =10，±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05

組別 相對光密度值對照組 0.88±0.38實驗組1 0.21±0.03?實驗組2 0.19±0.02?F值 615.622 P值 0.000

附圖 幼鼠藍斑核DBH表達 （×40）

3 討論

既往于DBH的研究，主要集中在機體的應(yīng)激狀態(tài)下，DBH、NA對于生理活動、運動的調(diào)節(jié)等方面。例如，在大鼠疼痛模型研究中[3]，發(fā)現(xiàn)脊髓的前角、外側(cè)角內(nèi)DBH陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，DBH受到上游因子AP-2α的調(diào)控，AP-2αmRNA水平增高，AP-2α蛋白合成升高，便引起DBH陽性產(chǎn)物增加；然而它沒有對腦藍斑區(qū)的DBH進行檢測，脊髓內(nèi)增加的DBH，既可能是藍斑區(qū)合成DBH增多進而轉(zhuǎn)運到脊髓，也有可能是其他性質(zhì)的神經(jīng)元發(fā)生轉(zhuǎn)化的結(jié)果。本實驗從幼鼠攝入2，4-D 慢性中毒 的模型入手，發(fā)現(xiàn)實驗組的幼鼠體重、腦重均隨著中毒時間的延長而落后于對照組。說明2，4-D不僅嚴重影響腦的生長活動，也會引發(fā)全身各器官、系統(tǒng)的發(fā)育滯后。

除草劑是被廣泛使用的化學制劑，在減少雜草、提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面起到重要作用；與此同時，也對土壤結(jié)構(gòu)、土質(zhì)造成一定損害。2，4-D屬于激素型除草劑，被葉片吸收后，轉(zhuǎn)運至植物的分生組織，導(dǎo)致莖干卷曲、葉片萎蔫，造成植物的死亡，是一種高效內(nèi)吸性除草劑[4]。DMSO是一種含硫有機化合物，對人體無毒，在研究中常常作為藥物的溶劑，用來加快藥物的吸收。本實驗未設(shè)置單獨注射DMSO的研究組，是因為DMSO沒有神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

研究表明[5]，中縫背核內(nèi)5-羥色胺核團與藍斑NA核團具有密切關(guān)聯(lián)，從中縫背核至藍斑核的纖維投射十分密集，該投射具有重要功能：如調(diào)節(jié)睡眠-覺醒狀態(tài)，維持機體警覺，調(diào)整認知變化及應(yīng)激反應(yīng)等。當藍斑核遭受毒性刺激時，中縫背核能夠產(chǎn)生抑制性效應(yīng)。中縫背核所含的5-羥色胺神經(jīng)元，通過其神經(jīng)終末釋放5-羥色胺，調(diào)節(jié)藍斑區(qū)DBH的濃度，控制NA的合成。

在2，4-D暴露下的幼鼠，STüRTZ等[6]發(fā)現(xiàn)，中腦的5-羥色胺神經(jīng)元免疫活性增強，同時伴有其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸的含量升高；而黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元TH免疫活性降低，也是受5-羥色胺調(diào)節(jié)的結(jié)果[7]；說明機體受到毒物侵害時，5-羥色胺神經(jīng)元通過自身或間接調(diào)節(jié)其他腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的變化，將損害降至最小。本研究在2個實驗組的藍斑核，發(fā)現(xiàn)DBH的表達降低，2個劑量組產(chǎn)生的效果相接近，提示當2，4-D使用劑量為70 mg/kg時，腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)已經(jīng)嚴重受損；可能此時的機體處于代償狀態(tài)，其體重、腦重并未無改變；隨著2，4-D劑量的增加，不僅腦藍斑區(qū)受損加劇，伴隨各系統(tǒng)代償失衡，甚至器官功能衰竭。最新的研究顯示[8]，藍斑核及其位于被蓋網(wǎng)狀核、內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)、脊髓后角的神經(jīng)纖維末梢，參與神經(jīng)損傷后導(dǎo)致的觸痛及痛覺過敏等癥狀。在損傷-康復(fù)過程中，藍斑核先是發(fā)揮抑制疼痛的作用，而后又使得疼痛加劇[9]。

綜上所述，由于藍斑區(qū)TH的水平受到5-羥色胺的負性調(diào)節(jié)，即5-羥色胺的濃度升高，TH的合成會減少，導(dǎo)致絡(luò)氨酸轉(zhuǎn)化生成多巴胺的量降低，最終合成NA的含量也減少。另一方面，升高的5-羥色胺通過纖維投射直接抑制DBH的活性，造成NA的合成減少。機體處在NA含量很低狀態(tài)下，其健康受到嚴重威脅，甚至連正常的生理活動都無法完成。如果新生兒攝入含有2，4-D的乳汁或乳制品，必然危害其發(fā)育。因此，在農(nóng)牧業(yè)領(lǐng)域，減少化學制劑的使用，不僅能夠改善生態(tài)環(huán)境，更有利于提高農(nóng)作物品質(zhì)，促進健康發(fā)展。