單寧、有機(jī)氮和pH值對(duì)森林土壤單寧-有機(jī)氮復(fù)合物沉降量的影響

邱 泓，馬紅亮，馬 芬，毛盼盼，高 人，尹云鋒

(濕潤(rùn)亞熱帶生態(tài)地理過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，福建福州 350007)

植物單寧(vegetable tannin)，別稱植物多酚(plant polyphenol)，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物[1]。它在維管植物中的含量?jī)H次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，主要存在于植物的皮、根、葉、果實(shí)中，含量可達(dá)20%[2-3]。單寧在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，紅樹植物的樹皮和果皮中往往具有較高含量的單寧，它們可形成保護(hù)層，起到抑制微生物活動(dòng)、殺滅病原菌的作用[4]。同時(shí)單寧還是一種化感物質(zhì)[5]，研究表明，Kalmia屬植物可通過(guò)產(chǎn)生單寧而影響腐殖質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)的循環(huán)，進(jìn)而引起云杉生長(zhǎng)的非生物學(xué)阻礙[6]。近年來(lái)，單寧在生態(tài)系統(tǒng)土壤氮循環(huán)中發(fā)揮的作用越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[7-9]。

氮循環(huán)是指自然界中的氮素以有機(jī)態(tài)、無(wú)機(jī)態(tài)和分子態(tài)的形式存在且互相轉(zhuǎn)化的過(guò)程[10]。其中，土壤有機(jī)氮主要以蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、氨基糖以及一些雜環(huán)狀的氮化合物等形式存在[11-12]，且不同生態(tài)系統(tǒng)中的有機(jī)氮(包括氨基酸和蛋白質(zhì))含量不同[13-14]。作為一種碳源，單寧可通過(guò)其自身性質(zhì)參與氮素循環(huán)，它在土壤中能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖等發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生不溶性復(fù)合物[15]。單寧影響土壤氮保持、降低土壤氮礦化量的研究已有許多報(bào)道，通過(guò)研究單寧對(duì)土壤淋溶層碳氮?jiǎng)討B(tài)的影響發(fā)現(xiàn)，單寧抑制總氨化速率的能力遠(yuǎn)高于纖維素，且可通過(guò)固定土壤中的氮，降低土壤的凈氮礦化量[7]。單寧酸的加入可降低土壤硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量[16]。源于石南科和冷杉的純化單寧主要通過(guò)捆綁或固定有機(jī)氮以及降低氮礦化量的形式來(lái)降低無(wú)機(jī)氮有效性[17]?？s合單寧可降低碳氮礦化量及酶活性，且可提高真菌和細(xì)菌的比值，因此，研究認(rèn)為，葉片組織中的縮合單寧濃度是影響微生物群落和活性的一個(gè)因素[8]。此外，單寧還與土壤微生物含量有關(guān)，在紅松林土壤中的單寧含量與土壤中的氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌含量呈正相關(guān)關(guān)系[18]。由于單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的產(chǎn)生與pH值條件有關(guān)[19]，因此，土壤理化性質(zhì)可調(diào)節(jié)單寧對(duì)氮素的影響。由于來(lái)自不同植物的單寧含量、結(jié)構(gòu)各異[7，20]，單寧對(duì)氮素轉(zhuǎn)化的影響也會(huì)因有機(jī)氮的類型及單寧含量的不同而有所差異，因此，探討不同單寧含量與土壤有機(jī)氮的關(guān)系已成為研究單寧對(duì)氮素轉(zhuǎn)化與保持的重要環(huán)節(jié)之一，而目前的研究主要將單寧和有機(jī)氮反應(yīng)形成單寧-有機(jī)氮復(fù)合物作為解釋單寧影響氮素的原因，但關(guān)于單寧和有機(jī)氮反應(yīng)形成單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的條件目前還不清楚，這制約了人們對(duì)其產(chǎn)物特性、動(dòng)態(tài)變化和氮循環(huán)的認(rèn)識(shí)。

本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)研究不同濃度的單寧酸與不同濃度的各種有機(jī)氮在2種pH值條件下的反應(yīng)，探究單寧與有機(jī)氮的關(guān)系，對(duì)明確單寧在生態(tài)系統(tǒng)土壤氮素循環(huán)中發(fā)揮的作用具有重要的理論參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 預(yù)試驗(yàn)

選用單寧酸(tannin acid，簡(jiǎn)稱TA)作為單寧代表物。配制不同濃度單寧酸，使其與不同濃度的各種氨基酸反應(yīng)，觀察發(fā)現(xiàn)，單寧酸能與堿性氨基酸中的精氨酸(arginine，簡(jiǎn)稱Arg)和賴氨酸(lysine，簡(jiǎn)稱Lys)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，因此選用精氨酸和賴氨酸進(jìn)行下一步試驗(yàn)。用不同濃度單寧酸與不同濃度牛血清蛋白(bovine serum albumin，簡(jiǎn)稱BSA)、酪蛋白(casein，簡(jiǎn)稱Cas)反應(yīng)，觀察發(fā)現(xiàn)，單寧酸與2種蛋白質(zhì)均能發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，因此選用2種蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。因此，選用單寧(單寧酸)和4種有機(jī)氮(精氨酸、賴氨酸、牛血清蛋白、酪蛋白)參與試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)3種濃度梯度，分別為HO組(高有機(jī)氮比例組)：含25 mg單寧酸和200 mg有機(jī)氮；M組(適中比例組)：含50 mg單寧酸和100 mg有機(jī)氮；HT組(高單寧比例組)：含100 mg單寧酸和50 mg有機(jī)氮。使用2種pH值梯度，分別為 0.2 mol/L pH值為4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.2 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

具體試驗(yàn)操作過(guò)程為在試管中加入10 mL緩沖液后，分別加入不同比例組的5 mL單寧酸和5 mL有機(jī)氮，HO組、M組、HT組單寧酸濃度分別為5、10、20 g/L，有機(jī)氮濃度分別為40、20、10 g/L，置于 200 r/min 搖床振蕩30 min后，然后在 4 000 r/min 離心機(jī)上離心10 min，收集清液，待測(cè)。

1.3 樣品分析

1.3.1 單寧含量測(cè)定 吸取1 mL樣液，加入5 mL 10%三乙醇胺和100 μL 0.05 mol/L氯化鐵，并用蒸餾水將溶液體積補(bǔ)充至20 mL，混勻，15 min后用紫外可見光譜儀(島津UV-2450，下同)測(cè)定混合液在510 nm處的吸光度[19]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 吸取1 mL樣液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250，混勻，10 min后用紫外可見光譜儀測(cè)定混合液在595 nm處的吸光度[21]。

1.3.3 精氨酸測(cè)定 吸取1 mL樣液，加入8 mL 15 g/L氫氧化鈉和1 mL顯色劑(含50 g/L甲萘酚、0.2 mL/L雙乙酰)，混勻，在30 ℃條件下水浴15 min，取出，在室溫條件下放置30 min后，混勻，然后用紫外可見光譜儀測(cè)定混合液在 525 nm 處的吸光度[22-23]。

1.3.4 賴氨酸測(cè)定 吸取1 mL樣品，加入2 mL茚三酮試劑和0.2 mL 0.2%維生素C溶液，混勻，蓋上玻塞，置于沸水中水浴加熱15 min后取出，并立即置于冰水中冷卻15 min，然后用60%乙醇溶液將溶液體積補(bǔ)充至20 mL，混勻，用紫外可見光譜儀測(cè)定混合液在570 nm處的吸光度[24]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.0和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，圖中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，不同處理與變量之間的顯著性檢驗(yàn)采用單因子方差分析(ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)后清液中的單寧酸與各有機(jī)氮濃度來(lái)計(jì)算參與反應(yīng)的單寧酸與有機(jī)氮的沉降量，探究單寧與有機(jī)氮的反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸與蛋白質(zhì)的反應(yīng)

由圖1可知，在pH值為4.7的條件下，M組的單寧酸沉降比例最高，為91.96%，HT組最低，為52.76%；牛血清蛋白沉降比例在M組最高，為93.87%，在HO組最低，為76.50%。單寧酸的沉降量在HT組最大，為52.76 mg，在HO組最小，為20.53 mg；牛血清蛋白的沉降量在HO組最大，為153.00 mg，在HT組最小，為42.01 mg。

在pH值為7.0的條件下，HT組單寧酸的沉降比例(48.71%)顯著低于其他2組；3組牛血清蛋白的沉降比例差異不顯著，均值為25.14%。單寧酸的沉降量在HT組最大，為48.71 mg，在HO組最小，為 23.22 mg；牛血清蛋白的沉降量在HO組最大，為50.77 mg，在HT組最小，為11.62 mg。

由圖2可知，在pH值為4.7的條件下，HO組單寧酸幾乎不參與反應(yīng)，其沉降比例僅為0.63%，HT組單寧酸(63.02%)顯著高于M組單寧酸(60.53%)；HO組酪蛋白的沉降比例最高，為98.59%，HT組最低，為94.74%。單寧酸的沉降量在HT組最大，為63.02 mg，HO組最小，僅為 0.16 mg；相反，酪蛋白的沉降量在HO組最大，為197.19 mg；在HT組最小，為47.37 mg。

在pH值為7.0的條件下，參與反應(yīng)的單寧酸和酪蛋白沉降比例的顯著性差異規(guī)律相同，兩者均在HT組最高(單寧酸為27.58%，酪蛋白為97.07%)，在M組最低(單寧酸為5.23%，酪蛋白為61.01%)。單寧酸的沉降量在HT組最大，為 27.58 mg，在M組最小，僅為2.62 mg；相反，酪蛋白的沉降量在HO組最大，為132.83 mg，在HT組最小，為48.54 mg。

2.2 單寧酸與氨基酸的反應(yīng)

由圖3可知，在pH值為4.7的條件下，單寧酸沉降比例在HO組最高，為81.97%，在HT組最低，為9.73%；各濃度梯度的賴氨酸沉降比例沒(méi)有顯著差異，均值為39.09%。單寧酸的沉降量在M組最高，為22.06 mg，在HT組最低，為 9.73 mg；賴氨酸的沉降量在HO組最大，為81.12 mg；在HT組最小，為18.34 mg。

在pH值為7.0的條件下，M組單寧酸沉降比例(38.27%)顯著高于其他2組；HO組(39.72%)賴氨酸沉降比例顯著低于其他2組。而單寧酸的沉降量在HT組最大，為29.91 mg，在HO組最小，為6.89 mg；賴氨酸的沉降量在HO組最大，為79.44 mg，在HT組最小，為22.63 mg。

由圖4可知，在pH值為4.7的條件下，M組的單寧酸沉降比例顯著高于其他2組，為45.41%；精氨酸沉降比例在M組最高，為57.00%，在HT組最低，為49.76%。單寧酸的沉降量在M組最大，為22.71 mg，在HO組最低，僅為3.42 mg；精氨酸的沉降量在HO組最大，為106.20 mg，在HT組最小，為 24.88 mg。

在pH值為7.0的條件下，單寧酸沉降比例沒(méi)有顯著差異，總體均值為44.21%；精氨酸沉降比例僅M組(59.78%)與HT組(58.02%)有顯著差異。單寧酸的沉降量在HT組最大，為41.48 mg，在HO組最小，為11.66 mg；精氨酸的沉降量在HO組最大，為117.71 mg，在HT組最小，為29.01 mg。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值可影響單寧-有機(jī)氮復(fù)合物的沉降量。酪蛋白、牛血清蛋白的等電點(diǎn)pH值分別為4.6、4.7。有研究發(fā)現(xiàn)，單寧和牛血清蛋白產(chǎn)生最高沉淀量的pH值接近于牛血清蛋白的等電點(diǎn)(pH值=4.7)[25]，其原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥最小[26]，此時(shí)蛋白質(zhì)容易發(fā)生凝集產(chǎn)生沉淀，因此在pH值為4.7的條件下，2種蛋白質(zhì)沉淀的比例和質(zhì)量整體較高；但在pH值=7.0時(shí)，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，依然有蛋白質(zhì)沉淀(雖然沉淀比例整體較等電點(diǎn)低)，說(shuō)明單寧具有結(jié)合蛋白質(zhì)的能力。HO組、M組、HT組單寧酸-牛血清蛋白復(fù)合物在pH值=4.7時(shí)的沉降量分別比 pH值=7.0時(shí)高134.53%、91.84%、57.09%；HO組、M組、HT組單寧-酪蛋白復(fù)合物在pH值=4.7時(shí)的沉降量分別比 pH=7.0時(shí)高44.38%、101.16%、45.02%；HO組、HT組的單寧酸-酪蛋白復(fù)合物的沉降量高于單寧酸-牛血清蛋白復(fù)合物的沉降量。Hagerman等研究發(fā)現(xiàn)，單寧在pH值大于9.0時(shí)會(huì)失去與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，這與單寧酚基的酸離解常數(shù)(pKa)有關(guān)[27]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在較低單寧含量(25 mg)的條件下，只要有較高含量的蛋白質(zhì)就會(huì)發(fā)生沉降，且與蛋白質(zhì)的類型有關(guān)。研究表明，白堅(jiān)木單寧、單寧酸與牛血清蛋白的反應(yīng)比例分別為 1 ∶4、2 ∶3[28]，而不同植物提純單寧與牛血清蛋白的反應(yīng)比例在2 ∶5～3 ∶5之間[15]。本研究中單寧酸與牛血清蛋白的反應(yīng)比例則為1 ∶7(HO組，pH值=4.7)～4 ∶1(HT組，pH值=7.0)；在相同pH值條件下，pH值=4.7時(shí)，該比例為1 ∶7(HO組)～6 ∶5(HT組)；pH值=7.0時(shí)，該比例為 1 ∶2(HO組)～4 ∶1(HT組)，說(shuō)明單寧與有機(jī)氮反應(yīng)的濃度比例會(huì)在很大程度上影響參與反應(yīng)的單寧和有機(jī)氮的量與比例。

HO組、M組單寧酸-賴氨酸復(fù)合物在pH值=4.7 時(shí)的沉降量分別比pH值=7.0高17.70%、0.49%；HO組、M組、HT組單寧酸-精氨酸復(fù)合物在 pH值=4.7時(shí)的沉降量分別比pH=7.0低15.27%、2.85%、47.01%，相同條件下單寧酸-精氨酸復(fù)合物的沉降量高于單寧酸-賴氨酸復(fù)合物的沉降量。本試驗(yàn)中賴氨酸、精氨酸的等電點(diǎn)分別是9.7、10.7，由于2種氨基酸的等電點(diǎn)與pH值=7.0條件更為接近，因此pH值=7.0時(shí)的氨基酸沉降量整體較pH值=4.7 條件大。在單寧與氨基酸的反應(yīng)中，氨基酸提供質(zhì)子化的氨基(NH3+)(在pH值高于7.0的條件下，沒(méi)有質(zhì)子化作用)，單寧提供負(fù)電荷(在pH值小于4.0的條件下，單寧幾乎不具有電荷數(shù))[29]，使得二者結(jié)合。精氨酸本身能夠形成多重氫鍵[30]，有研究發(fā)現(xiàn)，氫鍵在單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成中具有重要作用[31]，這可能是在單寧酸與氨基酸的反應(yīng)中，單寧酸-精氨酸復(fù)合物沉降量多于單寧酸-賴氨酸復(fù)合物沉降量的原因。在單寧酸與有機(jī)氮的反應(yīng)中，單寧酸-氨基酸復(fù)合物的沉降量低于單寧酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的沉降量，且并不是所有的氨基酸都和單寧發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，前期試驗(yàn)結(jié)果表明，丙氨酸、谷氨酸、甲硫氨基酸、無(wú)機(jī)氮不能與單寧酸反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，這與單寧性質(zhì)有關(guān)，本研究選用單寧酸作為單寧代表物，而在挪威云杉提純縮合單寧與20種氨基酸反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，單寧僅與精氨酸發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)[19]；從歐洲蕨(Pterdiumaquilinum)提取的單寧能與組氨酸反應(yīng)產(chǎn)生沉淀[32]；也有研究發(fā)現(xiàn)，縮合單寧(原花青素)能與丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸發(fā)生反應(yīng)[25]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單寧酸能與精氨酸、賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，進(jìn)一步說(shuō)明單寧結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性對(duì)有機(jī)氮沉降的影響不同。

一般來(lái)講，長(zhǎng)江以南的土壤多呈酸性或強(qiáng)酸性，長(zhǎng)江以北的土壤多呈中性或堿性[33]。細(xì)分到不同土壤，酸性或強(qiáng)酸性土壤有鐵鋁土、淋溶土、半淋溶土等；中性或堿性土壤有鈣層土、干旱土、漠土、初育土、半水成土、水成土、鹽堿土、高山土等[34]。典型的農(nóng)業(yè)土壤通常具有較高的pH值，有時(shí)甚至超過(guò)8.0[35]，我國(guó)亞熱帶的土壤主要呈酸性，pH值在4.0左右[36]；此外，各種土壤的單寧數(shù)量和結(jié)構(gòu)不同[31]。因此，單寧與有機(jī)氮形成的復(fù)合物在土壤中的作用與土壤類型有關(guān)。目前研究表明，穩(wěn)定的單寧和有機(jī)氮的復(fù)合物是土壤保留有機(jī)氮的重要機(jī)制[19，37]，單寧通過(guò)固定有機(jī)氮[7，17]降低土壤中的無(wú)機(jī)氮[16，38]，直接或間接影響土壤中微生物[37，39]的方式影響氮素轉(zhuǎn)化。Northup等研究認(rèn)為，單寧-蛋白復(fù)合物具有降低氮淋溶的作用，并可作為1個(gè)氮源被一些植物的菌根共生體重新利用[40]。雖然單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物很難被酶降解[41]，但其釋放氮素的現(xiàn)象已有報(bào)道[6，28]，而單寧-有機(jī)氮復(fù)合物與單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的降解性有何異同還未見報(bào)道。Adamczyk等研究發(fā)現(xiàn)，單寧不僅能與一些氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，還能與一些肽類、多胺、氨基糖類發(fā)生反應(yīng)[19]，因此，在土壤中單寧與有機(jī)氮的結(jié)合很可能是其影響氮轉(zhuǎn)化的重要原因。此外，單寧能與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)合物[42]。張瑞娜等研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸能與Fe3+離子反應(yīng)生成單寧酸鐵，而單寧酸鐵具有吸附無(wú)機(jī)氮的作用[43]，在土壤中也很有可能有相似反應(yīng)。因此，單寧在土壤中對(duì)氮素轉(zhuǎn)化的影響既要考慮凋落物性質(zhì)、數(shù)量的差異，也要考慮土壤類型和理化性質(zhì)的調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

單寧、有機(jī)氮和反應(yīng)溶液的pH值可影響單寧-有機(jī)氮復(fù)合物的沉降量。較低的pH值有利于沉降蛋白質(zhì)，較高的pH值有利于沉降氨基酸，且在相同條件下單寧酸沉降蛋白質(zhì)的量大于氨基酸。因此，在亞熱帶酸性土壤的氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程中蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化受單寧的影響可能較氨基酸大。