污水中耐紅霉素細菌的復(fù)活特性研究

汪喜生，呂瑞濱 ,沈怡雯,郭美婷

(1.上海城投污水處理有限公司石洞口污水處理廠，上海 200942 ；2.同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092 )

耐抗生素類藥物的濫用導(dǎo)致了環(huán)境中抗藥性細菌廣泛傳播，目前在地表水、地下水、土壤等中均檢測出多種抗生素耐藥細菌或耐藥基因[1-4]，因而普遍被認為是一種“新型污染物”[5]。病原菌之間耐藥基因的傳遞已成為治療相關(guān)疾病面臨的最大困難之一[6]。城市市政污水經(jīng)常接納各種醫(yī)療廢水和社區(qū)廢水，因而也成為耐藥細菌和耐藥基因的重要儲存地[7]。因此，控制和降低污水處理廠出水中細菌的耐藥性水平，對降低其健康風(fēng)險、提高污水再利用的安全性具有重要的意義。

消毒是污水處理廠處理流程的重要單元，也是再生水生產(chǎn)的必備單元。大量研究文獻表明，污水處理廠常規(guī)處理工藝不能有效降低細菌的耐藥性，因此消毒是控制和降低污水中微生物生態(tài)風(fēng)險的關(guān)鍵手段[8-9]。紫外線(Ultraviolet,UV)消毒技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展已相對成熟，在高效地滅活微生物的同時，有害消毒副產(chǎn)物生成很少，具有高效性、安全性和經(jīng)濟性等特征[10]，其應(yīng)用越來越廣泛。目前對紫外線消毒過程對抗生素耐藥細菌和耐藥基因去除效果的研究已取得了一些進展。大部分研究表明，紫外線消毒具有較顯著的殺滅耐藥細菌和耐藥基因的能力，但消毒劑量受污水水質(zhì)、耐藥細菌類型、接觸條件等因素的影響，通常需要較高消毒劑量以獲得較顯著的去除效果。如McKinney等[8]研究了紫外線消毒對污水中4種耐藥基因(mecA、vanA、tetA、ampC)的去除效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當消毒劑量為200～400 mJ/cm2時，耐藥基因的去除率為3～4 log。

此外，實際污水處理廠中的紫外線消毒設(shè)備容易受到運行年限、更換周期等因素的影響，其對耐藥細菌和耐藥基因的去除效果存在不穩(wěn)定性。由于不能提供持續(xù)的消毒效果，細菌復(fù)活現(xiàn)象也是削弱紫外線消毒殺菌效果的重要因素之一。已有研究學(xué)者對細菌復(fù)活的機理和影響因素等進行了研究。如Templeton等[11]研究指出，污水中的大腸桿菌和糞大腸桿菌會在照射過后的120 min內(nèi)快速地復(fù)活;Auertbach等[12]列舉出了可以光復(fù)活的細菌種類以及它們的復(fù)活機理，指出影響光復(fù)活的因素有光照條件、細菌類型和污水水質(zhì)等；McKinney等[8]研究了來自于加拿大的一個污水處理廠出水中糞大腸桿菌的光復(fù)活效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)過3 h的太陽光照射后，其平均光復(fù)活率為1.2個對數(shù)級。但是現(xiàn)有的光復(fù)活研究大部分停留在普通細菌層面，對于抗生素耐藥細菌光復(fù)活情況的研究較少涉及，而耐藥細菌的復(fù)活程度將在很大程度上影響其后續(xù)耐藥性風(fēng)險和再利用安全性，因而有必要針對紫外線消毒過程中耐藥細菌的復(fù)活特性展開調(diào)研。另外，根據(jù)相關(guān)文獻研究，細菌在經(jīng)過紫外線照射之后也會一定程度上發(fā)生暗復(fù)活現(xiàn)象，因此也有必要對不同復(fù)活方式細菌的復(fù)活情況展開進一步討論。

紅霉素在我國臨床治療等方面具有廣泛的應(yīng)用，其耐藥細菌和耐藥基因在污水處理廠污水中普遍被檢出。本文擬以耐紅霉素細菌作為研究對象，對典型的耐紅霉素細菌經(jīng)紫外線消毒后的復(fù)活特性展開試驗研究，考察了消毒劑量、復(fù)活方式、復(fù)活強度等因素對耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響。此外，為了評價復(fù)活強度的影響，對比了耐紅霉素細菌的光復(fù)活和暗復(fù)活的復(fù)活情況；為了比較不同類型耐紅霉素細菌的復(fù)活情況，選擇耐紅霉素異養(yǎng)菌、糞大腸菌群和單一大腸桿菌三類細菌作為研究對象，考察其在紫外線消毒處理過程中的復(fù)活特性，并評價了經(jīng)紫外線消毒處理后紅霉素耐藥性的后續(xù)生態(tài)風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 污水采集與耐紅霉素細菌的篩選

本次試驗所用污水取自上海市Q污水處理廠紫外線消毒前的水樣(即新鮮污水)，并作為實驗室紫外線消毒及后續(xù)復(fù)活的樣品。該污水處理廠服務(wù)人口約20萬人，主要進水為周邊居民生活污水，處理規(guī)模為60 000 m3/d，主體工藝為A2/O(厭氧—缺氧—好氧)脫氮除磷工藝，水力停留時間為7.7 h；為了保障脫氮效果，在二沉池后又設(shè)置了曝氣生物濾池，濾料負荷為0.35 kg NH3-N/(m3濾料·d)，處理后的污水采用紫外線消毒。將2 L水樣收集于無菌聚乙烯取樣瓶后，置于冰上儲存并運回實驗室立即進行后續(xù)試驗。采集污水的常規(guī)水質(zhì)指標見表1。

表1 試驗所用污水的常規(guī)水質(zhì)指標Table 1 Water quality indicators of wastewater for test

為了篩選耐紅霉素大腸桿菌，先將上述新鮮污水經(jīng)一系列梯度稀釋后各取1 mL加入含紅霉素(32 mg/L)的大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基(HB7001，海博生物，青島)中，充分振蕩混合，待冷卻凝固后于37 ℃培養(yǎng)24 h，從中挑選2～3株菌株分別接種至1 mL液體LB培養(yǎng)基(NaCl 10g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，萬古霉素32 mg/L，pH=7.2)中，于37℃150 r/min恒溫培養(yǎng)24 h；再將菌液于LB培養(yǎng)基平板(含紅霉素濃度為32 mg/L)進行劃線分離后，挑取4～5株單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，于37℃150 r/min恒溫培養(yǎng)24 h；最后取1%的量將上述菌液擴培后分裝于2 mL離心管中，加入甘油于-40℃保存。另取一管純菌液送至上海杰李生物公司測序，鑒定發(fā)現(xiàn)菌株類型為大腸桿菌K12。

取冰凍保存的大腸桿菌K12菌液復(fù)蘇，在10 000 r/min下離心10 min，棄上清液，用PBS緩沖溶液將沉淀重新懸浮，然后加入濾膜過濾后的污水處理廠二沉池出水，充分振蕩后即為制備好的菌懸液。

1.2 紫外線消毒處理

在實驗室采用低壓紫外平行光儀作為紫外線消毒光源，光源功率為120 W(TL 120 W/01,Philips)，光束在樣品表面中心位置的照射強度為0.17 mW/cm2，通過控制紫外線照射時間的長短來控制水樣消毒劑量。根據(jù)Germicidal Fluence低壓汞燈紫外線照射強度計算軟件，可計算出特定水樣在中心位置紫外線照射強度下消毒劑量與時間的關(guān)系[13]。參照實際污水處理廠紫外線消毒劑量，本試驗設(shè)定紫外線消毒劑量分別為1 mJ/cm2、10 mJ/cm2，對實際污水和篩選的耐紅霉素大腸桿菌K12樣品在實驗室進行了消毒試驗。經(jīng)紫外線消毒后的水樣用于測定耐紅霉素細菌的濃度。

1.3 復(fù)活處理

對紫外線消毒后的水樣進行復(fù)活處理，復(fù)活處理分光復(fù)活、暗復(fù)活處理。其中，光復(fù)活處理是在實驗室采用SPX-250B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱作為光源，通過光強控制光復(fù)活劑量，在420 nm處光強分別為50 μW/cm2、20 μW/cm2和7.5 μW/cm2(UV-M型紫外輻照計)，取20 mL采集的水樣放置于培養(yǎng)皿中，在室溫(25℃)于不同光強照射下處理1 h之后進行取樣，測定耐藥細菌的濃度；暗復(fù)活處理是將采集的水樣經(jīng)紫外線消毒處理后，取20 mL于培養(yǎng)皿中用錫紙包好于室溫(25℃)遮光處理4 h、24 h之后進行取樣，測定耐藥細菌的濃度。采用復(fù)活率評價細菌的復(fù)活情況，其計算公式為

(1)

式中：Np為復(fù)活后樣品細菌計數(shù)(CFU/mL)；N為紫外消毒后樣品細菌計數(shù)(CFU/mL)；N0為紫外消毒前樣品細菌計數(shù)(CFU/mL)。

1.4 耐藥細菌濃度的測定

本試驗選取紅霉素作為研究對象，檢測耐紅霉素異養(yǎng)菌、糞大腸菌群和大腸桿菌K12的濃度。

采用平板計數(shù)法進行耐紅霉素異養(yǎng)菌濃度的測定，具體測定方法如下：先將樣品在150 r/min搖床中振蕩3 min以充分混合樣品，取1 mL混合充分的樣品進行10倍連續(xù)梯度稀釋；再取1 mL以若干梯度稀釋的樣品分別置于皮氏培養(yǎng)皿，加入10 mL含8 mg/L紅霉素的營養(yǎng)瓊脂(蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L，pH=7.2)后充分搖蕩以混合培養(yǎng)基和樣品；待冷卻凝固后將樣品放入恒溫培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計菌落數(shù)在20～300 CFU/mL的培養(yǎng)皿，確定耐紅霉素異養(yǎng)菌的數(shù)目。每個梯度濃度的樣品均設(shè)置3個平行樣本。此外，將1 mL以同樣梯度稀釋的上述水樣加入不含紅霉素的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)計數(shù)操作，用來反映水樣中的耐紅霉素異養(yǎng)菌的總數(shù)。

耐紅霉素大腸桿菌K12濃度的測定參照上述耐紅霉素異養(yǎng)菌濃度的測定方法，不同之處只是將培養(yǎng)基換成培養(yǎng)大腸桿菌K12的LB培養(yǎng)基(酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂10 g/L，pH=7.2)。

采用濾膜法進行耐紅霉素糞大腸菌群的測定，具體測定方法如下：將適量水樣注入已滅菌的放有濾膜(孔徑0.22 um)的過濾裝置中，并將截留細菌的濾膜貼于澆注好的M-FC培養(yǎng)基(HB0154，青島海博)上，在44.5℃溫度下培養(yǎng)24 h，記錄顏色為藍色或藍綠色且菌落數(shù)在5～60 CFU/mL的培養(yǎng)皿，從而計算出每1 L水樣中含有耐紅霉素糞大腸菌群的數(shù)目。

紅霉素濃度值的選取依據(jù)為美國臨床實驗室標準化協(xié)會2011發(fā)布的耐藥性標準CLSI(2011版)[14]中規(guī)定的各病原菌對該抗生素具有抗藥性的最低抑菌濃度且取最大值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外線消毒劑量對耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響

為了考察紫外線消毒劑量對耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響，本試驗采集Q污水處理廠二沉池出水水樣對耐紅霉素細菌進行紫外線消毒復(fù)活處理(光復(fù)活、暗復(fù)活處理)，得到不同紫外線消毒劑量下耐紅霉素的異養(yǎng)菌、糞大腸菌群和大腸桿菌K12的復(fù)活率見表2。

表2 不同紫外線消毒劑量下3種耐紅霉素細菌的復(fù)活率Table 2 Reactivation of three types of erythromycin resistant bacteria under different disinfection dosages

由表2可知：

(1) 對于耐紅霉素異養(yǎng)菌，隨著消毒劑量的提高，經(jīng)紫外線消毒后細菌的復(fù)活率降低；對于不同復(fù)活條件下的耐紅霉素異養(yǎng)菌，在較低紫外線消毒劑量(1 mJ/cm2)下細菌的復(fù)活率(6.15%～21.54%)明顯高于較高紫外線消毒劑量(10 mJ/cm2)下細菌的復(fù)活率(0.18%～1.86%)。

(2) 對于耐紅霉素大腸桿菌K12，與耐紅霉素異養(yǎng)菌的復(fù)活趨勢類似，隨著消毒劑量的提高，紫外線消毒后細菌的復(fù)活率明顯降低；對于不同復(fù)活條件下的耐紅霉素大腸桿菌，在低紫外線消毒劑量(1 mJ/cm2)下細菌的復(fù)活率(3.61%～14.90%)明顯高于較高紫外線消毒劑量(10 mJ/cm2)下細菌的復(fù)活率(0.13%～0.87%)。

(3) 對于不同紫外線消毒劑量下耐紅霉素糞大腸菌群,其復(fù)活趨勢(見表4)也與耐紅霉素異養(yǎng)菌有相似之處，雖然總體復(fù)活水平不高，但均呈現(xiàn)出在較低紫外線消毒劑量(1 mJ/cm2)下細菌的復(fù)活率(1.02%～4.12%)明顯高于較高紫外線消毒劑量(10 mJ/cm2)下細菌的復(fù)活率(0.3%～0.09%)；對于部分細菌的復(fù)活率為負的情況，可以認為紫外線消毒后短時間的暗復(fù)活處理并不足以使暫時失活的細菌復(fù)活。耐紅霉素異養(yǎng)菌與耐紅霉素糞大腸菌群在復(fù)活過程中表現(xiàn)出相似的趨勢，即隨著紫外線消毒劑量的提高，細菌的復(fù)活被明顯抑制，這可能與細菌的復(fù)活機理有關(guān)。紫外線消毒機理是使得細菌DNA形成嘧啶二聚體從而無法進行蛋白質(zhì)合成和復(fù)制的調(diào)控，而細菌復(fù)活機制是首先復(fù)活酶與嘧啶二聚體結(jié)合，由于高紫外線消毒劑量處理后細菌DNA結(jié)構(gòu)被完全破壞，難以與復(fù)活酶結(jié)合，從而導(dǎo)致紫外線消毒劑量升高，細菌的復(fù)活程度降低。

2.2 復(fù)活條件對紫外線消毒后耐紅霉素細菌復(fù)活的影響

為了考察不同復(fù)活條件(方式)對耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響，本試驗對紫外線消毒后耐紅霉素的異養(yǎng)菌、糞大腸菌群和大腸桿菌K12在光復(fù)活、暗復(fù)活處理后的復(fù)活情況進行了研究，其試驗結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)活條件對紫外線消毒后3種耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響Fig.1 Reactivation of three types of erythromycin resistant bacteria after UV disinfection under different resuscitative modes

由圖1可見：對于耐紅霉素異養(yǎng)菌來說，光復(fù)活處理后細菌的復(fù)活率為6.1 %～21.4 %，而暗復(fù)活細菌的復(fù)活率維持在15.2 %左右；對于耐紅霉素糞大腸菌群，光復(fù)活處理后細菌的平均復(fù)活率均要高于暗復(fù)活處理；對比兩種典型的復(fù)活方式(光復(fù)活和暗復(fù)活)，在一定的紫外線消毒劑量下光復(fù)活處理后細菌的平均復(fù)活水平要高于暗復(fù)活處理；對于耐紅霉素大腸桿菌K12來說，光復(fù)活處理后細菌的平均復(fù)活率(3.7 %～14.9 %)也要高于暗復(fù)活處理(3.6 %～3.9 %)?？傮w上看，耐紅霉素細菌在光復(fù)活處理后的復(fù)活程度要普遍高于暗復(fù)活處理，這可能是因為在紫外線消毒后細菌復(fù)活是由光照催化進行的，因而在光照條件下細菌的復(fù)活情況會比黑暗條件下更為顯著。因此，對于污水處理廠污水經(jīng)紫外線消毒處理后，耐紅霉素細菌的光復(fù)活現(xiàn)象會在一定程度上增加生態(tài)風(fēng)險，應(yīng)引起重視。

2.3 復(fù)活強度對紫外線消毒后耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響

本試驗還對紫外線消毒處理后光復(fù)活和暗復(fù)活強度對耐紅霉素細菌復(fù)活程度的影響進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對于耐紅霉素異養(yǎng)菌和耐紅霉素大腸桿菌K12而言，在光復(fù)活處理的條件下，隨著光照強度的增強，細菌的復(fù)活程度不斷提高；而對于耐紅霉素糞大腸菌群而言，隨著光照強度的增強，細菌的復(fù)活率出現(xiàn)降低的趨勢，表明細菌的復(fù)活程度被抑制。 這可能是由于細菌光復(fù)活過程是由光照催化發(fā)生，因此隨著光照強度的增強耐紅霉素異養(yǎng)菌和耐紅霉素大腸桿菌K12的光復(fù)活程度也不斷提高；但對于耐紅霉素糞大腸菌群而言，由于糞大腸菌群主要生活在人畜腸道內(nèi)部，長期的黑暗環(huán)境生活使其對于光照較為敏感，較高的光照強度可能會抑制糞大腸菌群的生長。

對于耐紅霉素的異養(yǎng)菌、糞大腸菌群和大腸桿菌K12而言，其暗復(fù)活程度都隨著復(fù)活時間的延長而不斷增強，這說明在沒有光照催化的情況下，延長復(fù)活時間會促進耐藥細菌更為顯著的復(fù)活，因此對于污水處理廠出水進入管網(wǎng)之后，較長的復(fù)活時間會使得耐紅霉素細菌的生態(tài)風(fēng)險增大。

已有研究表明，紫外線消毒后細菌復(fù)活分兩個階段[15]：①復(fù)活酶與嘧啶二聚體形成絡(luò)合物，此反應(yīng)不需光照參加；②在光照催化下，嘧啶二聚體解聚恢復(fù)生物活性，復(fù)活酶脫落與其他嘧啶二聚體結(jié)合。當紫外線消素劑量較高時，細菌的DNA結(jié)構(gòu)被完全破壞，復(fù)活酶難以與嘧淀二聚體結(jié)合，因而高劑量紫外線消毒后細菌的復(fù)活程度很低。由于光催化加速了反應(yīng)進程，因此相較于暗復(fù)活，細菌的光復(fù)活程度更為明顯。對于耐紅霉素異養(yǎng)菌和大腸桿菌K12，隨著光照強度的增強催化速率不斷提升，使得細菌復(fù)活程度隨光照增強更為顯著；對于耐紅霉素糞大腸菌群，由于其多數(shù)處在人畜腸道黑暗的環(huán)境中，高光強對其生長有一定的抑制作用，因此強光情況下會抑制其復(fù)活情況。

對比研究耐紅霉素異養(yǎng)菌與耐紅霉素糞大腸菌群中細菌的復(fù)活特性可知，當紫外線消毒劑量為10 mJ/cm2時，耐紅霉素細菌基本沒有復(fù)活，說明耐紅霉素細菌中并不存在對紫外線消毒有強烈抗性的細菌種類。然而一般實際污水處理廠的紫外線消毒劑量常常低于5 mJ/cm2，甚至在1～2 mJ/cm2左右，此時經(jīng)紫外線消毒后耐紅霉素細菌的復(fù)活情況較為明顯，因此低紫外線消毒劑量下耐紅霉素細菌的后續(xù)生態(tài)風(fēng)險需要引起關(guān)注。

2.4 對耐紅霉素細菌復(fù)活的生態(tài)風(fēng)險控制

為了考察耐紅霉素細菌在紫外線消毒處理后復(fù)活時的生態(tài)風(fēng)險，對上述試驗得到的耐紅霉素細菌復(fù)活情況數(shù)據(jù)進行了整理分析，結(jié)果顯示：實驗室中紫外線消毒(劑量為1 mJ/cm2)處理后耐紅霉素細菌均出現(xiàn)較為顯著的復(fù)活情況，而實際污水處理廠的紫外線消毒劑量普遍不高(1 mJ/cm2左右)，說明污水處理廠經(jīng)紫外線消毒處理后的耐紅霉素細菌的生態(tài)風(fēng)險有一定的增加。其中，對于耐紅霉素異養(yǎng)菌，高光強的光復(fù)活會很大程度地增加其生態(tài)風(fēng)險；對于耐紅霉素糞大腸菌群，低光強的光復(fù)活對其生態(tài)風(fēng)險增加的影響最大。而對于耐紅霉素細菌的暗復(fù)活，長時間的暗復(fù)活處理也會使耐紅霉素細菌的復(fù)活程度更為明顯，提升其相應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險。

上述研究結(jié)果表明耐紅霉素細菌在經(jīng)過紫外線消毒處理后會出現(xiàn)一定的復(fù)活情況，這種復(fù)活情況以及受相應(yīng)影響因素的變化與紫外線消毒后細菌的復(fù)活機制有一定的聯(lián)系，光照催化復(fù)活反應(yīng)使得細菌復(fù)活隨光照增強更為顯著。本研究以紅霉素為例，考察了其耐藥細菌的復(fù)活特性，結(jié)果表明：10 mJ/cm2以上的紫外線消毒劑量可以有效地控制耐藥細菌的復(fù)活情況，但降低紫外線消毒劑量則會出現(xiàn)較為顯著的細菌復(fù)活情況，其中以光復(fù)活為主，耐藥細菌的生態(tài)風(fēng)險反而有所增加[16]。實際污水處理廠運行期間，尤其是當紫外線消毒設(shè)備運行年限較長時，其有效照射劑量一般低于5 mJ/cm2，此時耐藥細菌的生態(tài)風(fēng)險需要引起重視。

3 結(jié) 論

(1) 紫外線消毒劑量對于耐紅霉素細菌的復(fù)活有較為明顯的影響：低劑量紫外線消毒后耐紅霉素細菌會出現(xiàn)顯著的復(fù)活現(xiàn)象，而高劑量紫外消毒后其復(fù)活情況并不明顯；當紫外線消毒劑量為1 mJ/cm2時，耐紅霉素細菌的復(fù)活程度比10 mJ/cm2時更為顯著。

(2) 對于耐紅霉素細菌復(fù)活而言，光復(fù)活處理比暗復(fù)活處理更為顯著，對于提升其生態(tài)風(fēng)險貢獻較大。

(3) 耐紅霉素異養(yǎng)菌和大腸桿菌K12隨光照的增強其光復(fù)活程度顯著，而高光強在一定程度上會抑制耐紅霉素糞大腸菌群的復(fù)活；而對于耐紅霉素細菌的暗復(fù)活，長時間的暗復(fù)活處理會增加耐紅霉素細菌的復(fù)活程度，提升其生態(tài)風(fēng)險。

(4) 在實際污水處理廠運行過程中，低劑量紫外線消毒處理后會在一定程度上出現(xiàn)耐紅霉素細菌顯著復(fù)活的情況，而后收納水體經(jīng)光照處理后耐紅霉素細菌的復(fù)活情況會進一步顯著，相應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險也會不斷提升，因此耐紅霉素細菌的后續(xù)生態(tài)風(fēng)險必須要引起重視。

通訊作者：呂瑞濱(1981—)，男，工程師，主要從事化工環(huán)保、資源綜合利用、能源動力等技術(shù)應(yīng)用與實踐方面的研究。E-mail:lvruibin@126.com