D-核糖及肉桂醛對(duì)四川泡菜菌群多樣性和生物被膜的影響

劉 蕾，李婭琳，聶 蓉，錢 楊，厙 曉，陶雨飛，饒 瑜*

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

四川泡菜是中國(guó)泡菜的典型代表，歷史悠久，文化深厚，被譽(yù)為“川菜之骨”，堪稱“國(guó)粹”[1]。四川泡菜因其獨(dú)特的風(fēng)味深受人們喜愛(ài)，其產(chǎn)業(yè)已成為四川乃至我國(guó)特色產(chǎn)業(yè)支柱之一。由于其在發(fā)酵、發(fā)酵后加工和貨架期貯存中都保有豐富的微生物數(shù)量和多樣性，在一定條件下，被抑制的腐敗微生物能打破原有的微生物生態(tài)平衡而引發(fā)腐敗[2]。目前對(duì)四川泡菜腐敗的預(yù)防和控制，主要通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中采取措施和產(chǎn)品的防腐保鮮兩個(gè)方面。但現(xiàn)有的防腐保鮮方法已遇到各種瓶頸，因此，尋求新型的生物防腐劑，開發(fā)新型的生物防腐技術(shù)，已迫在眉睫[3]。

四川泡菜作為傳統(tǒng)的天然發(fā)酵食品，含有種類繁多的微生物。泡菜微生物組結(jié)構(gòu)解析的相關(guān)研究已開始開展，研究表明乳酸菌主導(dǎo)了泡菜發(fā)酵進(jìn)程，且本研究室前期也鑒定出多株與泡菜腐敗有關(guān)的微生物[4]。在泡菜發(fā)酵環(huán)境中，微生物之間可以通過(guò)群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)進(jìn)行交流，QS系統(tǒng)是細(xì)菌依賴于群體密度而調(diào)控其生理行為的一種機(jī)制。其中LuxS/AI-2型QS廣泛存在于G＋和G-菌中，在微生物跨種間信號(hào)交流方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)食品腐敗可能受QS系統(tǒng)調(diào)控。在不同的食品例如牛奶、肉和蔬菜中發(fā)現(xiàn)了QS信號(hào)分子AI-1和AI-2，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些與食品腐敗相關(guān)的酶如果膠酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、核酸酶、蛋白酶受QS調(diào)控[5-8]。群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitor，QSI）能用于防止食品表面腐敗菌或病原菌的定植、毒素產(chǎn)生和腐敗菌的增殖，因此具備作為新型生物防腐劑的巨大潛力[9]。然而，關(guān)于QS阻斷后會(huì)對(duì)發(fā)酵環(huán)境中的微生物菌群產(chǎn)生何種影響的相關(guān)研究尚處于起步階段。

前期研究已發(fā)現(xiàn)D-核糖是一種通用QSI[10-11]，且常被作用醫(yī)藥原料、保健品、中間體和食品添加劑[12-13]。已有報(bào)道稱肉桂醛也是一種QSI[14-18]，能夠有效抑制微生物的生理行為[19-24]。本研究在發(fā)酵泡菜中分別加入D-核糖及肉桂醛，檢測(cè)其對(duì)菌群多樣性的影響，并進(jìn)一步分析其對(duì)特定腐敗菌生理特性的影響，以期為今后QS抑制效應(yīng)在發(fā)酵泡菜防腐保鮮領(lǐng)域相關(guān)研究提供參考，并為發(fā)酵食品防腐保鮮技術(shù)開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 泡菜樣品

樣品來(lái)自成都紅光地區(qū)發(fā)酵泡菜，泡菜原料為大白菜，發(fā)酵方式為添加6 g/100 mL食鹽后天然發(fā)酵。

1.1.2 培養(yǎng)基

M R S培養(yǎng)基：包括蛋白胨1 0 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L。

LB培養(yǎng)基：包括胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.4，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.1.3 試劑

D-核糖、肉桂醛（均為食品級(jí)） 成都科龍化工試劑廠；2×Taq MasterMix（Dye） 康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Appiled Biosystems GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)美國(guó)Promega公司；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜樣品處理

根據(jù)前期研究結(jié)果及文獻(xiàn)[10]，將D-核糖和肉桂醛的作用濃度分別確定為200 mmol/L和100 μmol/L。將泡菜樣品（含泡菜液及泡菜）進(jìn)行分裝，之后分別添加D-核糖至終濃度200 mmol/L，即為D-核糖處理組，平行3 個(gè)樣本；添加肉桂醛至終濃度100 μmol/L，為肉桂醛處理組，平行3 個(gè)樣本；不添加D-核糖及肉桂醛的為對(duì)照組，平行3 個(gè)樣本。室溫保存1 個(gè)月至泡菜樣品出現(xiàn)變色、氣味不良、pH值升高的腐敗現(xiàn)象。

1.3.2 泡菜發(fā)酵液微生物基因組提取與測(cè)序

測(cè)序的基本實(shí)驗(yàn)流程為：泡菜發(fā)酵液DNA抽提→設(shè)計(jì)合成引物接頭→PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量與均一化→構(gòu)建PE文庫(kù)→Illumina測(cè)序。

DNA抽提：經(jīng)過(guò)PCR操作提取出DNA產(chǎn)物后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提出的PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增：按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫。熒光定量：根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

MiSeq文庫(kù)構(gòu)建：通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端，使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生DNA片段。

MiSeq測(cè)序：DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；以DNA片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物進(jìn)行PCR合成，在芯片上合成目標(biāo)待測(cè)DNA片段；變性、退火后，芯片上DNA片段的另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”；PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈。加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第1輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3’端黏性，繼續(xù)聚合第2個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

MiSeq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU可以進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 特定腐敗菌的分離與鑒定

以上述靜置1 個(gè)月的泡菜液為來(lái)源分離特定腐敗菌。采用無(wú)菌生理鹽水對(duì)原始泡菜液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，并涂布于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單克隆菌落。對(duì)挑取菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接、液體培養(yǎng)，菌液為PCR擴(kuò)增模板。分別以27F（3’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5’）和1541R（3’-AAGGAGGTGATCCACCC-5’）為上下游引物對(duì)上述菌液的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：27F 1 μL，1541R 1 μL，菌液模板2 μL，2×Mix 15 μL，ddH2O 11 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。后直接將PCR產(chǎn)物或切膠產(chǎn)物送去成都擎科梓熙有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將上述分離得到的特定腐敗菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，處理組分別添加終濃度為200 mmol/L的D-核糖或100 μmol/L的肉桂醛，將其置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)36 h，每2 h取樣，測(cè)定OD600nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，分別繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.6 生物被膜測(cè)定

生物被膜形成量檢測(cè)采用結(jié)晶紫染色法。將上述分離得到的特定腐敗菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，處理組分別添加終濃度為200 mmol/L的D-核糖或100 μmol/L的肉桂醛。將培養(yǎng)液加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后用磷酸鹽緩沖溶液輕柔沖洗3 次，去除懸浮菌體，室溫晾干。每孔加0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min，無(wú)菌水輕柔沖洗至洗液無(wú)色為止，室溫晾干。加100 μL無(wú)水乙醇充分溶解結(jié)晶紫。檢測(cè)OD595nm值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)試重復(fù)3 次，用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（ANOVA）及作圖。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-核糖及肉桂醛對(duì)四川泡菜微生物多樣性的影響

微生物多樣性測(cè)序的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，樣品檢測(cè)到的微生物共分布于1 個(gè)域，1 個(gè)界，4 個(gè)門，5 個(gè)綱，9 個(gè)目，11 個(gè)科，13 個(gè)屬，20 個(gè)種，OTU統(tǒng)計(jì)為22 個(gè)。在OTU水平進(jìn)行分析，對(duì)照組中Pediococcus ethanolidurans（OTU16）的數(shù)目最多（36 735），其次是unclassified Lactobacillus（OTU20）（8 275），不含有L. paucivorans（OTU18）。D-核糖處理后有明顯的變化，其中unclassified Lactobacillus（OTU15）的數(shù)目最多（34 646），其次是P. ethanolidurans（OTU16）（8 842），而不含有S. equorum（OTU4）、L. ginsenosidimutans（OTU6）、P. acnes subsp. acnes（OTU8）、L. lactis subsp. lactis（OTU9）。與對(duì)照組相比，肉桂醛處理后作用不明顯，其中P. ethanolidurans（OTU16）的豐度仍然最大（28 955），其次為unclassifiedLactobacillus（OTU20）（2 827），不含有L. paucivorans（OTU18）。

表1 微生物多樣性測(cè)序的OTU信息統(tǒng)計(jì)Table 1 OTU information from microbial diversity analysis

如圖1所示，對(duì)照組P. ethanolidurans占比最多，為76.35%，其次為unclassifiedLactobacillus，占比為19.38%，此外，還檢測(cè)出L. sakei，占比1.70%，以及B. gunnisoniana，占比1.45%。肉桂醛處理后的群落分布中P. ethanolidurans占比依然最多，上升為85.34%，unclassifiedLactobacillus、L. sakei及B. gunnisoniana占比分別變?yōu)?0.22%、2.23%及1.28%。D-核糖處理組的變化顯著，其中占比最多的是unclassifiedLactobacillus，占到80.10%，而P. ethanolidurans的占比降為19.21%。該結(jié)果表明D-核糖和肉桂醛會(huì)對(duì)四川泡菜的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且D-核糖的作用強(qiáng)于肉桂醛。

圖1 泡菜樣品在屬水平的微生物群落分布餅圖Fig. 1 Genus-level distribution of microbial community in Sichuan pickle

圖2 肉桂醛處理組與對(duì)照組在屬水平的微生物Veen圖（A）和Heatmap圖（B）Fig. 2 Veen chart (A) and Heatmap (B) of microbial communities in control vs. cinnamaldehyde treatment groups at genus level

圖3 D-核糖處理組與對(duì)照組在屬水平的微生物Veen圖（A）和Heatmap圖（B）Fig. 3 Veen chart (A) and Heatmap (B) of microbial communities in control vs. D-ribose treatment groups at genus level

如圖2所示，經(jīng)肉桂醛處理后與處理組有18 個(gè)屬為共同所有，Heatmap圖表明樣本群落結(jié)構(gòu)變化不明顯，Lactobacillus的占比下降，P. ethanolidurans占比上升。如圖3所示，經(jīng)D-核糖處理后與處理組有15 個(gè)屬為共同所有，Heatmap圖表明樣本群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，且Lactobacillus占比顯著上調(diào)，這表明D-核糖對(duì)維持泡菜中的Lactobacillus比例具有積極的作用。

2.2 D-核糖及肉桂醛對(duì)四川泡菜源腐敗微生物生長(zhǎng)曲線的影響

圖4 D-核糖及肉桂醛對(duì)P. calida（A）、P. ananatis（B）、P. anthophila（C）及S. saprophyticus（D）生物曲線的影響Fig. 4 Effects of D-ribose and cinnamaldehyde on growth curves of P. calida (A), P. ananatis (B), P. anthophila (C) and S. saprophyticus (D)

從四川泡菜樣本中分離出多株特定腐敗菌，選擇其中4 株進(jìn)行后續(xù)研究。分別為Pantoea calida、Pantoea ananatis、Pantoea anthophila以及Staphylococcus saprophyticus。

如圖4所示，D-核糖對(duì)4 種微生物的生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響，而肉桂醛對(duì)它們的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。其中，對(duì)P. calida從開始就表現(xiàn)出明顯的抑制作用（圖4A），對(duì)P. ananatis、P. anthophila及S. saprophyticus初期（0～10 h）生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用，但是直至穩(wěn)定期，三者的OD600nm數(shù)值均顯著低于對(duì)照組。從OD600nm看，肉桂醛處理后P. calida菌量只能達(dá)到對(duì)照組的一半，P. ananatis、P. anthophila及S. saprophyticus的菌量也與對(duì)照組有顯著差異。然而，2.1節(jié)中關(guān)于微生物不同屬的相對(duì)占比結(jié)果卻顯示肉桂醛的影響不明顯，這說(shuō)明肉桂醛對(duì)單個(gè)微生物的抑菌作用并不會(huì)顯著影響其菌群相對(duì)占比情況，菌群結(jié)構(gòu)的變化更有可能是微生物群體信號(hào)交流改變的結(jié)果。

2.3 D-核糖及肉桂醛對(duì)四川泡菜源腐敗微生物生物被膜形成的影響

圖5 D-核糖及肉桂醛對(duì)P. calida（A）、P. ananatis（B）、P. anthophila（C）及S. saprophyticus（D）生物被膜的影響Fig. 5 Effects of D-ribose and cinnamaldehyde on bio film formation of P. calida (A), P. ananatis (B), P. anthophila (C) and S. saprophyticus (D)

如圖5所示，P. calida在加入D-核糖和肉桂醛之后，其生物被膜OD595nm值分別為0.353 3和0.313 7，對(duì)比對(duì)照組的OD595nm值3.132 5，分別降低至11%和10%，二者作用效果明顯。P. ananatis在加入D-核糖和肉桂醛之后，生物被膜OD595nm值分別為0.401 8和0.330 5，對(duì)比對(duì)照組OD595nm值1.914 3，降低至21%和17%，作用效果也較明顯。P. anthophila在加入D-核糖和肉桂醛之后，其OD595nm值分別為0.313 5和0.257 7，對(duì)比對(duì)照組的OD595nm值2.805 2，分別降低至11%和9%，作用效果明顯。S. saprophyticus在加入D-核糖和肉桂醛之后，其OD595nm值分別為0.305 8和0.418 0，對(duì)比未加入對(duì)照組的OD595nm值2.856 7，分別降低至11%和15%，作用效果很明顯。綜上，D-核糖和肉桂醛對(duì)4 種腐敗菌的生物被膜形成均具有顯著的抑制作用（P＜0.01）。

3 討 論

多數(shù)研究表明，乳酸菌是發(fā)酵泡菜的主要微生物[25-27]。有研究人員對(duì)家庭制作的四川泡菜微生物組進(jìn)行深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和變形菌門的微生物占99%，從種的角度看，占比最多的是Lactobacillus，其次是Pediococcus；從屬的角度看，L. acetotolerans占比最多，其次是L. brevis和P. ethannolidurans[28]。在泡菜發(fā)酵的最后階段，L. plantarum和L. casei為主要微生物[29]。也有報(bào)道稱L. acteotolerans和L. brevis是家庭制作泡菜的主要微生物[28]。有研究人員對(duì)不同原料的四川發(fā)酵泡菜的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus在榨菜、蘿卜中為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，在豇豆中為主要優(yōu)勢(shì)菌[30]。本研究室曾對(duì)不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵中的微生物數(shù)量、分布及變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus plantarum和Lactobacillus pentosus為主的乳酸菌主導(dǎo)了泡菜發(fā)酵過(guò)程，而Bacillus subtilis和Candida tanzawaensis等菌株與泡菜腐敗有關(guān)[2]。在本研究中，檢測(cè)的對(duì)照樣品在室溫條件下存放1 個(gè)月，其主要微生物為P. ethanoliduran，而Lactobacillus占比為第2位，這表明泡菜中的微生物群落發(fā)生了變化，不利于泡菜品質(zhì)控制。而加入D-核糖的處理組中，依然是Lactobacillus占比最多，表明D-核糖可能具有維持泡菜品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)于核糖調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究鮮見報(bào)道，但前期已有研究表明核糖可作為QSI調(diào)節(jié)單個(gè)微生物的生理行為。有報(bào)道稱D-核糖能夠抑制信號(hào)分子AI-2從而減弱很多種微生物生物被膜的形成，例如Fusobacterium nucleatum、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola[31-32]。在Aggregatibacter actinomycetemcomitans中，核糖對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，但可以與AI-2競(jìng)爭(zhēng)受體LsrB和RbsB，從而抑制AI-2誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制其生物被膜的形成[33-34]。前期研究也發(fā)現(xiàn)200 mmol/L的D-核糖對(duì)Lactobacillus paraplantarumL-ZS9和Bifidobacterium animalisRH的生長(zhǎng)情況沒(méi)有顯著影響，但可以抑制它們的生物被膜形成[10,35]。且通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出L. paraplantarumL-ZS9中受D-核糖調(diào)控的基因[10]。本研究特定腐敗菌生長(zhǎng)曲線及生物被膜形成的相關(guān)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，表明D-核糖可以在不顯著影響其生長(zhǎng)的情況下抑制被膜的形成，這說(shuō)明D-核糖對(duì)被膜形成的抑制作用可能是通用的。而關(guān)于D-核糖是通過(guò)抑制QS還是同時(shí)伴隨著代謝途徑的改變從而影響這幾株菌的生理行為，還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在泡菜發(fā)酵環(huán)境中，D-核糖可以對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且可以將Lactobacillus的占比大幅提高。

肉桂油因其特殊的芳香廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[36-38]。肉桂醛是一種無(wú)毒的風(fēng)味物質(zhì)，被認(rèn)為是安全的，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、口香糖、香料及食品化學(xué)領(lǐng)域[39]。有研究表明肉桂醛能夠有效抑制兩種?；呓z氨酸內(nèi)酯介導(dǎo)的QS及AI-2介導(dǎo)的QS[40]，它能夠在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的前提下通過(guò)減弱LuxR的DNA結(jié)合能力從而干擾Vibriospp.的AI-2介導(dǎo)的QS[17]。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂油能夠有效拮抗Streptococcus mutans和L. plantarum的生物被膜[41]。肉桂醛能夠影響B(tài)urkholderia multivorans、Burkholderia cenocepacia、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli和Vibriospp.的生物被膜形成，且會(huì)提升被膜對(duì)抗生素處理的敏感性[15-17,42-45]。也有研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)于中國(guó)臺(tái)灣的土肉桂能夠明顯抑制9 種革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌的浮游態(tài)生長(zhǎng)，其中包括methicillin-resistantStaphylococcus aureus和Staphylococcus epidermidis[37]。肉桂醛的作用機(jī)制可能是抑制質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)、呼吸鏈、電子傳遞和基質(zhì)氧化，從而導(dǎo)致氧化磷酸化去偶聯(lián)、主動(dòng)運(yùn)輸抑制、代謝產(chǎn)物丟失、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的代謝受阻[46-50]。肉桂作為調(diào)味品添加進(jìn)泡菜制品中[51]。關(guān)于肉桂醛及其衍生物對(duì)各種發(fā)酵環(huán)境中的微生物組的相關(guān)研究非常匱乏。曾有研究發(fā)現(xiàn)在瘤胃發(fā)酵環(huán)境中，肉桂醛可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌，但是具有濃度依賴性[52]。且有研究發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物會(huì)對(duì)一些植物提取物在第7天左右產(chǎn)生適應(yīng)，從而其對(duì)微生物發(fā)酵的影響消失[53]。本研究結(jié)果表明肉桂醛對(duì)泡菜環(huán)境中微生物組成的影響不顯著，這有可能是所選擇濃度不是最適宜作用濃度，也有可能是添加時(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致微生物組的產(chǎn)生適應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)分別外源添加D-核糖和肉桂醛這兩種QSI于四川泡菜發(fā)酵液中，經(jīng)微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)D-核糖處理可以使樣本群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，且Lactobacillus相對(duì)占比明顯上調(diào)，這表明D-核糖對(duì)維持泡菜中的Lactobacillus比例具有積極的作用；而肉桂醛的作用并不明顯。進(jìn)一步分析D-核糖及肉桂醛對(duì)分離自樣品中的特定腐敗菌的生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)D-核糖及肉桂醛均可以顯著抑制特定腐敗菌P. calida、P. ananatis、P. anthophila及S. saprophyticus的生物被膜形成。以上研究為今后QS抑制效應(yīng)在發(fā)酵泡菜防腐保鮮領(lǐng)域相關(guān)研究提供參考，并為發(fā)酵食品防腐保鮮技術(shù)開發(fā)提供新的思路。