車前三個(gè)不同部位中主要化學(xué)成分含量差異及其黃嘌呤氧化酶體外抑制作用比較*

李晶 劉雯 陳超 虞金寶

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

車前科植物車前（Plantago asiatica L.）是中醫(yī)臨床中利濕通淋常用藥車前子和車前草的植物來源之一，在我國(guó)各地均有分布，主產(chǎn)于江西、四川、江蘇、河南和浙江等地[1]。全國(guó)第四次中藥資源普查調(diào)查結(jié)果顯示，江西車前主要分布于泰和縣、吉水縣、永修縣、樟樹縣和新干縣。隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的不斷深入，我省作為該兩種藥材的道地產(chǎn)區(qū)，每年車前的種植面積為3萬余畝，畝產(chǎn)車前子約180 kg，即每年車前子產(chǎn)量高達(dá)5 400噸，按車前子與廢棄物植株產(chǎn)量比例1∶4計(jì)，每年車前取車前子后的廢棄植株產(chǎn)量超過2萬噸，而目前車前廢棄植株最常見的利用方式是還田，利用效率相對(duì)較低。基于車前子和車前草有較高的藥用價(jià)值及良好的市場(chǎng)前景，我們根據(jù)其化學(xué)成分和藥理藥效的共同點(diǎn)，針對(duì)性地開展了對(duì)車前不同部位主要化學(xué)成分的含量差異研究及其黃嘌呤氧化酶體外抑制作用的比較研究，以探索車前廢棄植株的利用前景?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 HP-1260全自動(dòng)高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），Simplicity TM個(gè)人型超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博公司），CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所），AG-135電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 材料 車前的三個(gè)不同部位車前草、車前子和車前取車前子后廢棄植株均來源于江西省泰和縣不同季節(jié)采集的車前植物標(biāo)本，均經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院虞金寶研究員鑒定為車前科植物車前（Plantago asiatica L.）的不同部位。大車前苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：111914-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院），毛蕊花糖苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：111530-201512，中國(guó)食品藥品檢定研究院），京尼平苷酸對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：111828-201403，中國(guó)食品藥品檢定研究院），黃嘌呤對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：140662-200802，中國(guó)食品藥品檢定研究院），尿酸對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：CAS#69-93-2，上海源葉生物科技有限公司），黃嘌呤氧化酶對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：CAS#902-17-9，上海源葉生物科技有限公司），別嘌醇對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：CAS#315-30-0，上海源葉生物科技有限公司），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 車前三個(gè)不同部位主要化學(xué)成分的含量差異比較

2.1.1 指標(biāo)確立 2015年版中國(guó)藥典[2]中對(duì)車前子藥材制定了分別以毛蕊花糖苷和京尼平苷酸為檢測(cè)指標(biāo)的含量限度，車前草藥材標(biāo)準(zhǔn)中則制定了大車前苷的最低含量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取大車前苷、毛蕊花糖苷和京尼平苷酸為檢測(cè)指標(biāo)對(duì)車前的三個(gè)不同部位進(jìn)行含量測(cè)定及比較。

2.1.2 對(duì)照品溶液 分別精密稱取大車前苷、毛蕊花糖苷和京尼平苷酸適量，用60%甲醇溶解并稀釋成濃度為每1ml含大車前苷29.0μg、毛蕊花糖苷30.818 μg和京尼平苷酸31.52μg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 車前三個(gè)不同部位供試品溶液 取車前三個(gè)不同部位粉末（過二號(hào)篩）各約1.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入60%甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再次稱重，用60%甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液適量用微孔濾膜（孔徑0.45 μm）濾過，作為供試品溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.1%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫，流動(dòng)相梯度（0～1 min為5∶95；1～40 min 為 5→60∶95→40；40～50 min 為5∶95）；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm 和 330 nm。在此條件下，對(duì)照品溶液中大車前苷、毛蕊花糖苷和京尼平苷酸與車前三個(gè)不同部位供試品溶液在相同時(shí)間有色譜峰相對(duì)應(yīng)，且與其它相鄰色譜峰均能獲得大于2.0的較好分離度。見圖1～2。

圖1 車前不同部位中毛蕊花糖苷和大車前苷的色譜圖（檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）

圖2 車前不同部位京尼平苷酸的色譜圖（檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm）

2.1.5 不同部位中主要成分的含量比較 按“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備各供試品溶液，每個(gè)部位平行制備供試品溶液2份，分別測(cè)定車前三個(gè)不同部位中大車前苷、毛蕊花糖苷和京尼平苷酸的峰面積并計(jì)算含量。見表1。

表1 不同部位中主要成分的含量比較（mg/g，n=2）

2.2 車前三個(gè)不同部位的黃嘌呤氧化酶體外抑制作用比較

2.2.1 車前不同部位供試品溶液的制備 取車前草、車前子和車前取車前子廢棄植株粉末（過二號(hào)篩）各約0.5 g，精密稱定，分別置于具塞三角瓶中，精密加入60%甲醇25 ml，加熱回流2 h，放冷，搖勻，濾過，收集濾液，以60%甲醇洗滌容器，洗滌液并入濾液，濃縮至近干后轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶，加1 ml二甲基亞砜助溶，并以PBS定容至刻度，作為車前不同部位供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇 -0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（2∶98），流速：1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。在此條件下，對(duì)照品溶液中尿酸和黃嘌呤對(duì)照品與車前不同部位供試品溶液在相同保留時(shí)間有色譜峰相對(duì)應(yīng)，且與其它相鄰色譜峰均能獲得較好的分離度。見圖3。

圖3 酶促反應(yīng)HPLC測(cè)定色譜圖

2.2.3 反應(yīng)緩沖液（PBS）的配制 精密稱取磷酸二氫鉀0.482 6 g、三水合磷酸氫二鉀3.483 0 g和乙二胺四乙酸18.42 mg，加入純凈水適量超聲使溶解并定容至250 ml，即得。

2.2.4 尿酸對(duì)照品溶液 精密稱取尿酸對(duì)照品15.01 mg，置于100 ml量瓶中，加PBS適量超聲使溶解并定容至刻度，制成濃度為0.150 1 mg/ml的尿酸對(duì)照品溶液。

2.2.5 黃嘌呤對(duì)照品溶液 精密稱取黃嘌呤對(duì)照品9.24 mg，置于50 ml量瓶中，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl使溶解并用PBS定容至刻度，制成濃度為1.216 mmol/L的黃嘌呤對(duì)照品溶液。

2.2.6 黃嘌呤氧化酶儲(chǔ)備液 精密稱取黃嘌呤氧化酶對(duì)照品適量，用PBS適量溶解并定容，制得濃度為56.56 U/L的黃嘌呤氧化酶儲(chǔ)備液。

2.2.7 別嘌醇對(duì)照品溶液 精密稱取別嘌醇對(duì)照品7.26 mg，置于100 ml量瓶中，加入少量二甲基亞砜使溶解并用PBS定容至刻度，制成濃度為0.534 mmol/L的別嘌醇對(duì)照品溶液。

2.2.8 酶促反應(yīng)時(shí)間考察 精密吸取150 μl的0.534 mmol/L別嘌醇對(duì)照品溶液10份，加入黃嘌呤氧化酶儲(chǔ)備液400 μl，37℃孵化15 min后，分別加入黃嘌呤對(duì)照品溶液400 μl啟動(dòng)反應(yīng)，分別于37℃ 反 應(yīng) 15、20、25、30、35、40、45、50、55 和 60 min后，加入1 mol/L鹽酸500 μl終止反應(yīng)，并用PBS分別定容至2 ml作為供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。通過計(jì)算尿酸生成量與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系判定，酶促反應(yīng)以30 min為宜。見圖4。

圖4 酶促反應(yīng)速度曲線

2.2.9 酶促反應(yīng)酶濃度優(yōu)化 分別精密吸取濃度為 565.600、282.800、113.120、56.560、28.280、14.140和5.656 U/L黃嘌呤氧化酶儲(chǔ)備液各400 μl，37℃孵化15 min后，分別加入1.216 mmol/L的黃嘌呤對(duì)照品溶液400 μl啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃反應(yīng)30 min后，分別加入1 mol/L鹽酸500 μl終止反應(yīng)，并用PBS定容至2 ml作為供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)尿酸生成量與酶濃度間的關(guān)系確定56.56 U/L為體系最佳酶濃度。

2.2.10 酶促反應(yīng)底物濃度優(yōu)化 精密吸取56.56 U/L黃嘌呤氧化酶儲(chǔ)備液400 μl，37℃孵化15 min后，加入 400 μl濃度分別 0.121 6、0.304 0、0.608 0、1.216 0、2.432 0、6.080 0和 12.160 0 mmol/L 的黃嘌呤對(duì)照品溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，于37℃反應(yīng)30 min后，分別加入1 mol/L鹽酸500 μl終止反應(yīng)，并用PBS定容至2 ml作為供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。通過尿酸生成量與加入底物濃度間的關(guān)系判定在56.56 U/L黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中黃嘌呤的最適濃度為1.216 mmol/L。

2.2.11 酶促反應(yīng)體系 取車前不同部位供試品溶液各150 μl，加入濃度為56.56 U/L的黃嘌呤氧化酶儲(chǔ)備液400 μl，37℃孵化15 min后，加入濃度為1.216 mmol/L的黃嘌呤對(duì)照品溶液400 μl啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃反應(yīng)30 min后，加入1 mol/L鹽酸500 μl終止反應(yīng)，用PBS定容至2 ml作為供試品溶液。同時(shí)設(shè)置PBS空白組，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的黃嘌呤氧化酶抑制率[3]。抑制率（%）=[實(shí)驗(yàn)組30 min反應(yīng)體系黃嘌呤濃度－空白組30 min反應(yīng)體系黃嘌呤濃度]/[空白組0 min反應(yīng)體系黃嘌呤濃度－空白組30 min反應(yīng)體系黃嘌呤濃度]×100%。

2.2.12 不同部位體外抑制作用差異 取2.2.1項(xiàng)下車前不同部位供試品溶液進(jìn)行酶促反應(yīng)，經(jīng)HPLC法分別測(cè)定后計(jì)算各部位的黃嘌呤氧化酶抑制率。結(jié)果顯示，車前三個(gè)部位的體外抑制作用存在一定的差異，同一濃度水平下，通常作為廢物處理的車前廢棄植株供試品溶液的黃嘌呤氧化酶抑制率高達(dá)42.60%，我們推測(cè)其藥理作用可能與車前草和車前子一致，可降低尿酸的形成，并具有利尿功效；同時(shí)結(jié)合表1中3個(gè)主要指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該三個(gè)成分的含量與其黃嘌呤氧化酶體外抑制作用不存在明顯的量效關(guān)系，對(duì)于車前三個(gè)不同部位的黃嘌呤氧化酶體外抑制作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步探索。見表2。

表2 車前不同部位黃嘌呤氧化酶抑制作用比較（%，n=2）

3 討論

在對(duì)車前三個(gè)不同部位的主要成分含量測(cè)定研究中，分別對(duì)流動(dòng)相、比例和洗脫方式進(jìn)行了優(yōu)化，本研究結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫可使各主要成分達(dá)到很好的基線分離，且色譜峰對(duì)稱性良好；在供試品溶液制備方法的研究中，分別比較了超聲與回流提取的效果，并對(duì)提取時(shí)間和溶劑用量進(jìn)行了摸索，本研究結(jié)果顯示，以2015年版《中國(guó)藥典》收錄的車前子含量測(cè)定項(xiàng)下的方法提取效果最優(yōu)；此外，在前期文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)，方蕓和吳祥松等[4～5]分別對(duì)車前草和車前子藥材進(jìn)行了桃葉珊瑚苷的含量測(cè)定研究，因此，我們也分別對(duì)車前三個(gè)不同部位進(jìn)行了桃葉珊瑚苷的含量測(cè)定，可能由于產(chǎn)地差異，本研究結(jié)果顯示，各部位中桃葉珊瑚苷的含量均較低，故本文中未將其列入含量差異比較。

隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的不斷推進(jìn)，中藥產(chǎn)業(yè)化種植所產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物日趨增多，對(duì)廢棄物的資源化利用一方面可以緩解資源短缺的緊張局面，另一方面還可有效地控制由農(nóng)業(yè)生產(chǎn)導(dǎo)致的環(huán)境污染。目前，我省對(duì)車前廢棄植株最常見的利用方式是還田，但其綜合利用率還是較低。通過本次體外藥效實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，車前廢棄植株有較好的黃嘌呤氧化酶體外抑制作用，因此為探索其利用價(jià)值，我們將進(jìn)一步開展其對(duì)高尿酸血癥大鼠降血尿酸作用的研究。