馬俊興,何俊峰,崔 燕,張 倩,劉鵬剛
(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,蘭州 730070)
隨著海拔的升高,空氣中的氧氣含量會逐漸減少,造成長期暴露于高海拔環(huán)境中的哺乳動物會發(fā)生高山病。而生活在海拔3 000~6 000 m 高寒地區(qū)的牦牛(Bosgrunniens)已具有適應這種高原低氧環(huán)境的穩(wěn)定遺傳學特性[1-3]。低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)為低密度脂蛋白受體家族中的一員,起初發(fā)現(xiàn)它主要與脂蛋白特別是殘余乳糜微粒的清除有關,它有30多種配體分子,參與體內多種生理和病理過程[4]。通過配體競爭結合研究發(fā)現(xiàn),與LRP的其他配體相比,結締組織生長因子CTGF對LRP有非常高的親合力;而其他配體與LRP具有中等親合力。目前,CTGF與LRP之間高親合力的機制尚不清楚,但這種高親合力提示,LRP會在介導CTGF的生物學效應方面起重要作用;經(jīng)基因敲除LRP基因缺陷細胞不能結合CTGF等研究證實,LRP是CTGF的受體,CTGF在細胞的快速內吞和降解過程依賴LRP[5]。LRP6作為CTGF受體之一,不僅與CTGF結合,還參與發(fā)育[6]。VEGFR2又稱激酶功能區(qū)受體(kinase domain receptor,KDR),不僅是受體酪氨酸蛋白激酶。血管內皮細胞生長因子型受體2(VEGFR2)同時還是VEGF的主要功能受體。作為受體型酪氨酸激酶,主要通過調節(jié)血管內皮細胞的通透性,促進細胞有絲分裂趨化作用以及新生血管的形成,除此之外,還在抗內皮細胞凋亡、維持內皮細胞存活方面發(fā)揮重要作用[7]。VEGFR2與肺血管內皮細胞的凋亡有關。CTGF和VEGF與低氧條件下的肺有著十分緊密的聯(lián)系[8-9]。國內外許多學者對LRP6和VEGFR2在肺癌、非小細胞肺癌和大鼠肺內的分布特點進行了研究[10-15]。本課題組之前對牦牛肺的組織結構進行過較為詳細的研究[16-17]。研究表明,CTGF表達與分布是成年牦牛的基礎分布,成年牦牛肺并未發(fā)生典型的肺纖維化或肺動脈高壓的病理特征,即成年牦牛并未產(chǎn)生肺動脈高壓。而在低氧環(huán)境下能刺激初生牦牛肺內VEGF含量增高,從而對牦牛的發(fā)育產(chǎn)生影響。但有關LRP6和VEGF在牦牛肺的分布特點未見報道。
本研究采用酶聯(lián)免疫吸附方法、Western blot和免疫組織化學,對LRP6和VEGFR2在初生、半歲、成年和老年牦牛肺準確分布位置和表達量進行觀察比較,為低氧環(huán)境下牦牛肺適應性結構的形成和機理提供部分理論基礎,同時也為心肺疾病的治療、高原醫(yī)學和運動醫(yī)學的研究提供部分理論資料。
本試驗以牦牛為研究對象,分別采集新生(1~7日 齡)、半歲(5~6月齡)、成年(3~6歲)和老年(7~10 歲)健康牦牛肺組織樣品,每個年齡段各5頭 份,經(jīng)頸動脈放血處死后,迅速采集肺膈葉的肺組織,固定于4%多聚甲醛溶液中,脫水、石蠟包埋,切片厚4 μm。其中新生牦牛購自甘肅省甘南自治州,其余組別牦牛購自青海省西寧市。
1.2.1 材料 ELISA試劑盒購于武漢基因美生物科技有限公司(LRP6,JYM0135Bo;VEGFR2,JYM0139Bo)。
1.2.2 蛋白樣品的提取 采集組織樣本后,稱重。加入一定量的PBS(pH7.4)。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨?,仍然保?~8 ℃的溫度。加入一定量的PBS(pH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心5 min(2 000~3 000 r·min-1)。收集上清液。分裝后,1份備用,其余-20 ℃冷凍保存。
1.2.3 方法 采用雙抗夾心ELISA法,用純化的LRP6和VEGFR2抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被抗體的微孔中依次加入LRP6和VEGFR2,再與HRP標記的LRP6和VEGFR2抗體結合,形成抗體-抗原-酶標記抗體復合物,經(jīng)過徹底洗滌后,加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉為藍色。用酶標儀在450 nm波長下的測定吸光值(OD值),通過標準曲線計算樣本中LRP6和VEGFR2濃度。
1.3.1 蛋白樣品的制備 取各個年齡段牦牛肺組織樣品各0.1 g,分別加入等量的組織均質緩沖液(1 mLRIPA+10 μLPMSF),冰浴搖勻2 h,然后4 ℃,12 000 r·min-1離心5 min,吸取上清液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 方法 取各年齡段牦牛肺的總蛋白各60 μL,分別加入20 μL溴酚藍混勻,100 ℃煮10 min,冰上5 min,然后將蛋白進行SDS-PAGE,再用濕轉法將其電極轉移至硝酸纖維膜(NC)上,從正極~負極的順序按4層濾紙、NC膜、凝膠塊、4層濾紙的順序擺放整齊,然后經(jīng)50 g·L-1脫脂奶粉溶液室內封閉1.5 h,分別用LRP6和VEGFR2抗體4 ℃過夜孵育,用HRP標記山羊抗小鼠IgG溫孵育1.5 h,每步完成后,用PBST洗膜,每次洗10 min,最后用ECL避光顯色,X光顯影、定影。掃描蛋白印跡條帶。
1.4.1 抗體及檢測系統(tǒng) 抗體和SP試劑盒均購自北京博奧森生物科技有限公司(Rabbit Anti-LRP6,bs-2905R;Rabbit Anti-VEGFR2,bs-10412R);DAB 顯色試劑盒購自中杉金橋公司。
1.4.2 免疫組織化學染色 石蠟切片貼于免疫組化防脫切片上。60 ℃烘片4~6 h。切片脫蠟至水,蒸餾水浸泡5 min,PBS浸泡5 min。按照試劑盒說明書步驟進行處理,DAB顯色。LRP6多克隆抗體和VEGFR2多克隆抗體均按照1∶400稀釋后使
用,空白對照用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗。
1.4.3 結果判定 以陽性表達強度為判定標準。深棕黃色為強陽性表達,淺棕黃色為陽性表達,淺黃色為弱陽性表達,接近背景色或無色為陰性。照片均通過Olympus-BX51生物顯微鏡和Olympus DP73照相系統(tǒng)進行拍攝。
由表1和圖1A可知,LRP6在初生和半歲的濃度均差異不顯著(P>0.05),初生、半歲與成年和老年的LRP6濃度值均差異顯著(P<0.05),成年和老年的LRP6濃度差異顯著(P<0.05)。由表1和圖1B可知,VEGFR2在初生和半歲的濃度差異不顯著(P>0.05),初生、半歲與成年和老年的VEGFR2濃度差異均顯著(P<0.05),成年和老年的VEGFR2濃度差異顯著(P<0.05)。
表1LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺的濃度
Table1TheconcentrationofLRP6andVEGFR2inthelungofyaksatdifferentages
年齡 Age初生Newborn半歲Juvenile成年Adult老年Old LRP6 /(pg·mL-1)133.357±3.341c143.272±4.321c190.278±2.935b242.323±1.987aVEGFR2 /(mg·mL-1)136.028±2.414c140.074±3.040c173.378±4.186b241.954±3.909a
同一行字母不同表示組間差異顯著(P<0.05),同一行字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)
Different letters mean significant differences in the same row among different groups (P<0.05), same letters mean no difference in the same row among different groups (P>0.05)
不同年齡組間,字母不同代表組間差異顯著(P<0.05),字母相同代表組間差異不顯著(P>0.05)。下同Different letters mean significant differences among diferent age groups (P<0.05), same letters mean no difference among diferent age groups (P>0.05).The same as below圖1 LRP6(A)和VEGFR2(B)在不同年齡牦牛肺的濃度Fig.1 The concentration of LRP6 (A) and VEGFR2(B) in the lung of yaks at different ages
由圖2B可知,LRP6在初生和半歲牦牛肺的表達均差異不顯著(P>0.05),初生、半歲與成年和老年牦牛肺LRP6表達均差異顯著(P<0.05),成年和老年牦牛肺LRP6表達差異顯著(P<0.05)。由圖2C可知,在初生和半歲牦牛肺VEGFR2表達差異不顯著(P>0.05),初生、半歲與成年和老年牦牛肺VEGFR2表達均差異顯著(P<0.05),成年和老年牦牛肺VEGFR2表達差異顯著(P<0.05)。
2.3.1 LRP6在牦牛肺的分布和表達情況 LRP6在初生和半歲年齡段牦牛肺的分布和表達量基本一致,在細支氣管(圖3a)、終末細支氣管(圖3b)、呼吸性細支氣管(圖3c)上皮細胞中以及肺泡
A. Western-blot結果; B. LRP6; C. VEGFR2A.The result of Western-blot; B. LRP6; C. VEGFR2圖2 不同年齡中LRP6和VEGFR2蛋白在牦牛肺的表達Fig.2 The expressions of LRP6 and VEGFR2 protein in yak lung at different ages
Ⅱ型細胞中(圖3d)呈弱陽性表達,在細支氣管動脈(圖3a)、伴行肺動脈(圖3b)內膜上皮細胞和平滑肌也有分布,呈陽性表達。成年牦牛肺細支氣管(圖3e)、終末細支氣管(圖3f)上皮細胞和肺泡Ⅱ型細胞成陽性表達,呼吸性細支氣管(圖3g)上皮細胞的表達和初生以及半歲基本一致。而在老年牦牛肺細支氣管(圖3h)、終末細支氣管(圖3i)、呼吸性細支氣管(圖3j)上皮細胞呈強陽性表達,在細支氣管肺動脈和肺泡Ⅱ型細胞(圖3k)中也有大量分布,呈強陽性表達。圖3l為空白對照。
2.3.2 VEGFR2在牦牛肺的分布情況 VEGFR2在初生和半歲年齡段牦牛肺的分布和表達量也基本一致,在細支氣管(圖4a)、終末細支氣管(圖4b)、呼吸性細支氣管(圖4c)上皮細胞中和平滑肌細胞以及肺泡Ⅰ型細胞中(圖4d)呈弱陽性表達,在細支氣管動脈(圖4a)、伴行肺動脈(圖4b)內膜細胞也有分布,也呈弱陽性表達。在成年牦牛肺在細支氣管(圖4e)上皮和管壁平滑肌中強陽性表達;在終末細支氣管(圖4f)只有上皮有陽性表達及管壁平滑肌中無表達;在呼吸性細支氣管(圖4g)和Ⅰ型肺泡上皮細胞和肺泡隔細胞(圖4h)內強陽性表達。在伴行肺動脈血管壁平滑肌細胞和內皮細胞陽性表達(圖4f)。而在老年牦牛肺細支氣管(圖4i)、終末細支氣管(圖4j)、呼吸性細支氣管上皮和管壁平滑肌中以及Ⅰ型肺泡上皮細胞和肺泡隔細胞(圖4k)上皮細胞呈強陽性表達,圖4l為空白對照。
a.初生牦牛肺細支氣管及肺動脈;b.半歲牦牛肺終末細支氣管及伴行動脈;c.初生牦牛肺呼吸性細支氣管;d.半歲牦牛肺泡囊;e.成年牦牛肺細支氣管及肺動脈;f.成年牦牛肺終末細支氣管及伴行動脈;g.成年牦牛肺呼吸性細支氣管;h.老年牦牛肺細支氣管及肺動脈;i.老年牦牛肺終末細支氣管及伴行動脈;j.老年牦牛肺呼吸性細支氣管;k.老年牦牛肺泡囊;l.空白對照。B.細支氣管;TB.終末細支氣管;RB.呼吸性細支氣管;PA.肺動脈;AS.肺泡囊。下同a.Newborn yak lung bronchioles and pulmonary arteries; b.Juvenile yak lung terminal bronchiole and accompanying artery; c.Newborn yak lung respiratory bronchioles; d.Juvenile yak lung alveolar sac; e.Adult yak lung bronchioles and pulmonary arteries; f.Adult yak lung terminal bronchioles and accompanying arteries; g. Adult yak lung respiratory bronchioles; h.Old yak lung bronchioles and pulmonary arteries; i.Old yak lung terminal bronchioles and accompanying artery; j.Old yak lung respiratory bronchioles; k.Old yak lung alveolar; l. The blank control; B.Bronchioles; TB.Terminal bronchioles; RB. Respiratory bronchioles; PA.Pulmonary artery; AS.Alveolar sacs. The same as below圖3 免疫組織化學染色檢測LRP6在不同年齡牦牛肺的表達(a、c、d、e、g、h、i、k、l:400×;b、f、j:200×)Fig.3 Immunohistochemical expression of LRP6 in the lung of yak at different ages(a,c,d,e,g,h,I,k,l:400×;b,f,j:200×)
表2LRP6在不同年齡牦牛肺中的表達情況
Table2TheLRP6expressioninthelungatdifferentagesyak
年齡Age細支氣管Bronchioles肺動脈Pulmonary artery終末細支氣管Terminal bronchiole上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle內膜Ti中膜Tm外膜Ta上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle呼吸性細支氣管Respiratorybronchiole肺泡囊Alveolar sacs初生 Newborn+++-+++++半歲Juvenile+++-+++++成年Adult++++++++++++老年Old++++++++++++++
+++.強陽性表達;++.陽性表達; +.弱陽性表達;-.陰性表達。下同
+++.The strong positive expression; ++.The positive expression; +.The weak positive expression; -.The negative expression. The same as below
圖4 免疫組織化學染色檢測VEGFR2在不同年齡牦牛肺的表達(a、c、d、e、g、h、i、k、l:400×;b、f、j:200×)Fig.4 Immunohistochemical expression of VEGFR2 in the lung of yak at different ages(a,c,d,e,g,h,i,k,l:400×;b,f,j:200×)
表3VEGFR2在不同年齡牦牛肺中的表達情況
Table3TheVEGFR2expressioninthelungatdifferentagesyak
年齡Age細支氣管Bronchioles肺動脈Pulmonary artery終末細支氣管Terminal bronchiole上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle內膜Ti中膜Tm外膜Ta上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle呼吸性細支氣管Respiratorybronchiole肺泡囊Alveolar sacs初生Newborn+++++++++半歲Juvenile+++-+++++成年Adult+++++++++++老年Old++++++++++++++
VEGFR2廣泛存在于正常機體的組織器官中。筆者觀察到肺內VEGFR2主要分布于肺泡Ⅱ型細胞,支氣管上皮細胞、肺血管平滑肌細胞、成纖維細胞、肺泡巨噬細胞及肺血管內皮細胞也有VEGFR2表達。生長發(fā)育過程中,肺組織內皮血管增生、遷移、出芽、新生心血管形成與細胞外基質重塑都需要VEGFR2參與[18]。有研究證實在新生大鼠予以VEGFR2受體拮抗劑后肺組織內皮細胞凋亡增加,出現(xiàn)肺氣腫樣病變[19]。VEGFR2與血導管、血管形成和造血有關。提示VEGFR2是血導管生成的主要調控因子[20]。Hanahan和Folkman[21]1996年提出了“血管形成的開關平衡假說”,認為血管生成受多種促進因子和血管生成抑制因子的共同調控,當生長因子的濃度下降時,開關處于開放狀態(tài)導致血管形成。成年時期由于肺部血管內皮細胞增生不活躍,此時VEGFR2可能對維持肺血管的正常生理功能起一定的作用。VEGFR2是血管生長和發(fā)育的主要調節(jié)者,它們不僅在內皮細胞上有表達,在非內皮細胞上也有表達。說明VEGFR2可能在維持正常生理狀況及抗損傷修復中發(fā)揮作用。
本研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加,牦牛肺組織中的VEGFR2表達也逐漸上升,本研究結果與Hanahan和Folkman[21]對血管內皮生長因子及其受體在大鼠肺發(fā)育過程中的表達研究結果不同,大鼠肺內VEGFR2不僅在胎兒及新生兒肺內表達,以后也持續(xù)存在,但水平很低。這可能表明牦牛隨著年齡的增長,肺組織中內皮細胞增生、遷移能力顯著上升,其抗損傷能力也隨之上升。肺內VEGFR2逐漸增加以滿足其生長需要,說明可能與牦牛所處的高原低氧環(huán)境有關系。
LRP6是Wnt信號轉導途徑必不可少的受體[6],通過LRP6抑制Wnt信號傳導降低了肺癌細胞體內自我更新的能力[22]。Wnt信號途徑是胚胎早期發(fā)育過程中調控細胞生長、發(fā)育和分化的關鍵途徑,使細胞沿著某一方向定向分裂,使新產(chǎn)生的細胞定位于某個區(qū)域,決定著細胞分化的命運[23], 并在涉及肺癌發(fā)展的多個過程中發(fā)揮作用[24]。LRP6與結締組織生長因子CTGF有高度的結合能力,證實LRP6是CTGF的受體之一[5]。筆者觀察到LRP6在牦牛不同發(fā)育時期肺組織中支氣管上皮細胞、平滑肌細胞和肺動脈等也均有表達。這與Wang等[25]對Wnt信號傳導通過LRP6作用激活上皮細胞和血管平滑肌細胞的研究結果相似。隨著已有大量研究報道LRP6作為Wnt信號傳導的受體可調節(jié)肺上皮細胞和內皮細胞的黏附、增殖、遷移和生長促進血管生長和細胞外基質沉積,調節(jié)血管生成因子的產(chǎn)生或活性,并參與直接和間接的血管生成調節(jié)機制,從而引起肺動脈和小動脈重塑[26-28]。
本研究結果表明:1)在分布區(qū)域上,VEGFR2和LRP6均在肺內支氣管及其分支的上皮細胞、平滑肌細胞表達較高。2)在年齡方面,LRP6和VEGFR2在牦牛肺組織中表達豐富且在不同年齡段的表達有差異。說明這2種因子可能共同作用于牦牛肺細胞,促進肺動脈重建以抵抗高原低氧對肺的損傷。為進一步研究高原低氧對牦牛肺的損傷,還需對牦牛肺進行更深入的研究,從而為探索治療肺疾病提供新的思路。