犬乳腺腫瘤中MUC1的表達(dá)及臨床意義

刁洪秀，李 藝，林德貴，張 迪

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193)

乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床最常見的腫瘤之一，在所有犬貓腫瘤性疾病中排名第二位，而犬乳腺腫瘤約占犬臨床腫瘤性疾病的50%[1]，嚴(yán)重威脅寵物的健康。腫瘤是一個(gè)及其復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程，多種原癌基因或抑癌基因的異常表達(dá)與乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。在人醫(yī)研究中發(fā)現(xiàn)，MUC1在腫瘤的侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]，并能激活MAPK、PI3K/AKT和Wnt信號通路[3]，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在獸醫(yī)臨床上尚未見到相應(yīng)的報(bào)道。本研究通過熒光定量PCR(real-time PCR)和免疫組織化學(xué)(IHC)檢測MUC1基因和MUC1在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)情況，并分析其與腫瘤惡性分級的相關(guān)性，為犬乳腺腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

本試驗(yàn)共檢測了47例犬乳腺腫瘤病例，年齡7～16歲(11.29±2.43)，所有病例均來自于2014年5月至2015年12月間來中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院就診的病例。無菌收集腫瘤組織，一部分迅速用液氮冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)于-80 ℃冰箱保存。另一部分于4%多聚甲醛固定后制備病理切片，并進(jìn)行免疫組化染色。

1.2 主要試驗(yàn)試劑

RNAgentsRTotal Isolation System 試劑盒(Promega公司)，real-time PCR試劑盒(SYBR?Premix DimerEraserTM)、Reverse Transcription PCR試劑盒(TaKaRa生物公司)，2×EasyTaqSuperMix(全式金生物技術(shù)有限公司)，MUC1單克隆抗體(Abcam)，SP-9002生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)等。

1.3 RNA的提取和cDNA的合成

參照RNAgentsRTotal Isolation System 試劑盒說明提取樣本中的RNA，通過NanoDrop檢測RNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm的值在1.8～2.0，說明提取的RNA純度符合檢測要求。cDNA合成體系： RNA 1 μg、Oligo(dT) 1 μL、DEPC H2O 10 μL、5× PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL、dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL、RTase M-MLV(200 U·μL-1)0.5 μL、RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.5 μL，RNase Free dH2O補(bǔ)充至 20 μL。將上述混合物42 ℃ 延伸1 h，70 ℃ 保溫15 min 后終止反應(yīng)，cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MUC1基因的擴(kuò)增

參照NCBI上已經(jīng)發(fā)表的犬MUC1基因的mRNA序列(GenBank登錄號為AY703457)，利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物，上游引物：5′-GCCAACAAGGTGAAGACACAG-3′；下游引物：5′-CAGACTTGAACGGGGCAGA-3′，其目的產(chǎn)物片段長度為118 bp。

以“1.3”合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：模板 2 μL、上游引物(10 μmol·L-1)1 μL、下游引物(10 μmol·L-1)1 μL、2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL、去離子水補(bǔ)充至 25 μL，充分混勻。反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.5 MUC1基因的real-time PCR檢測

通過比較CT法進(jìn)行相對定量，選用的內(nèi)參基因是β-actin。參照NCBI上已經(jīng)發(fā)表的犬β-actin基因的mRNA序列(GenBank登錄號為NM001195845)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物，上游引物：5′-ATATCGCTGCGCTTGTGGTC-3′；下游引物：5′-CCGTGCTCAATGGGGTACTTC-3′。

構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將cDNA進(jìn)行梯度稀釋，得到5個(gè)梯度模板(100、10-1、10-2、10-3、10-4)進(jìn)行real-time PCR檢測，根據(jù)模板拷貝數(shù)的對數(shù)和CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。real-time PCR反應(yīng)體系:模板1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物 0.5 μL、SYBR?Premix DimerEraserTM10 μL、ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL，去離子水補(bǔ)充至 20 μL，充分混勻。real-time PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃數(shù)據(jù)采集1 s，共36個(gè)循環(huán)。60～90 ℃熔解曲線，0.3 ℃·s-1，60 ℃退火15 s，終止反應(yīng)。

1.6 組織病理切片的制作

腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后，經(jīng)過脫水、透化、浸蠟、包埋、切片等程序，切割成3 μm的石蠟切片。經(jīng)HE染色中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察。

1.7 組織中MUC1的檢測

將“1.6”中的石蠟切片經(jīng)脫水、抗原修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色等過程進(jìn)行IHC檢測。

IHC結(jié)果判讀：細(xì)胞結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒即存在MUC1蛋白的表達(dá)。對每個(gè)IHC樣本隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行拍照，然后采用Image Pro Plus對照片平均光密度值(MOD)進(jìn)行分析，陽性染色面積與目標(biāo)蛋白的量成正比，染色的強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白的關(guān)系符合朗伯-比爾定律。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織學(xué)鑒定

本試驗(yàn)共收集乳腺腫瘤病例47例，參照2011年Goldschmidt等[4]提出的犬乳腺腫瘤的分類和分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類和惡性程度分級，詳見表1和表2。惡性腫瘤27例，良性腫瘤20例，組織惡性程度分級見表3。

表1組織惡性分級標(biāo)準(zhǔn)

Table1Criteriaforhistologicmalignantgrade

評分Score腺管形成Adenosine formation核多形性Nuclear pleomorphism高倍鏡視野下染色High power fields1分腺管形成良好輕度細(xì)胞核多形性和核染色每個(gè)視野下偶爾有核深染和有絲分裂相2分中等量腺管形成中度細(xì)胞核多形性和核染色每個(gè)視野下2-3個(gè)核深染或有絲分裂相3分少量或無腺管形成明顯細(xì)胞核多形性和核染色每個(gè)視野下多于3個(gè)核深染或有絲分裂相

表2乳腺腫瘤組織惡性分級

Table2Histologicmalignancygradeofmammaryneoplasms

總分Score惡性分級Malignancy grade3～5Ⅰ級(低度惡性),高分化6～7Ⅱ級(中度惡性),中度分化8～9Ⅲ級(高度惡性),低分化

表3乳腺腫瘤組織惡性程度分級

Table3MalignancygradeofMGTssamples

惡性程度分級Malignancy grade數(shù)量Number比例/%ProportionⅠ933.3Ⅱ1348.1Ⅲ510.4

2.2 MUC1基因表達(dá)

2.2.1MUC1和β-actin基因的擴(kuò)增MUC1和β-actin基因PCR擴(kuò)增得到如下瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果：在100～200 bp之間以及200 bp水平出現(xiàn)清晰的單一條帶，與預(yù)測的MUC1和β-actin特異性引物擴(kuò)增條帶大小相符(圖1)。

2.2.2 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 以Cycle為橫坐標(biāo)，不同模板濃度的對數(shù)(log Quantity)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.990，標(biāo)準(zhǔn)曲線可信度高，二者的擴(kuò)增效率相近。

2.2.3 real-time PCR動力學(xué)曲線 對樣本中的mRNA轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行real-time PCR試驗(yàn)，生成的擴(kuò)增曲線如圖3。

2.2.4 real-time PCR熔解曲線MUC1和β-actin熔解曲線均為單峰，產(chǎn)物特異性高，詳見圖4。

M.相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.β-actin；4～6.MUC1，均為惡性腫瘤樣品M. DNA marker; 1-3. β-actin; 4-6. MUC1, all samples were malignant mammary tumors圖1 MUC1和β-actin基因cDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of cDNA by canine MUC1 and β-actin

2.2.5MUC1基因定量轉(zhuǎn)錄差異性分析 應(yīng)用2-ΔΔCt對MUC1基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行定量分析，詳見圖5。在腫瘤組織(n=47)和正常組織(n=3)中MUC1基因相對轉(zhuǎn)錄量分別為12.50±4.95和1.55±0.64，二者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)。在不同的惡性分級中，MUC1基因相對轉(zhuǎn)錄量差異較大(圖6)。在Ⅰ級(n=9) 、Ⅱ級(n=13)和Ⅲ級(n=5)中相對轉(zhuǎn)錄量依次為2.25±1.48、1.75±1.41和30.24±11.24，Ⅲ級中MUC1基因相對轉(zhuǎn)錄量顯著高于Ⅰ級和Ⅱ級(P值分別是0.016和0.011)。

2.3 組織中MUC1的表達(dá)

乳腺腫瘤組織MUC1部分IHC結(jié)果見圖7，MUC1在正常乳腺組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈低表達(dá)，在乳腺腫瘤組織中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的著色，呈強(qiáng)陽性表達(dá)。經(jīng)Image Pro Plus計(jì)算得出，正常組織(n=3)和腫瘤組織(n=47)的MOD分別為0.14±0.02和0.19±0.08，二者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.03)，詳見圖8。

圖2 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of real-time PCR amplification

圖3 real-time PCR動力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.3 Dynamic curve of real-time PCR amplification

圖4 real-time PCR熔解曲線Fig.4 Melting curve of real-time PCR amplification

*.P<0.05圖5 腫瘤組和正常組MUC1基因相對轉(zhuǎn)錄量Fig.5 Relative transcription of MUC1 in different groups

*. P<0.05圖6 不同惡性級別中MUC1基因相對轉(zhuǎn)錄量Fig.6 Relative transcription MUC1 in different malignance grades

惡性腫瘤組織(n=27)和良性腫瘤組織(n=20)的MOD分別為0.18±0.08和0.21±0.08，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在不同的惡性分級中MUC1表達(dá)有差異，Ⅰ級(n=9)的MOD顯著低于Ⅱ級(n=13)和Ⅲ級(n=5) 的MOD(P值分別為0.01和0.00)，見圖9。

a.正常乳腺組織；b、c、d.簡單癌組織a. Normal mammary tissue; b, c and d. Simple mammary cancer tissue圖7 MUC1在犬不同乳腺組織中的表達(dá) 400×Fig.7 Expression of MUC1 in canine mammary tumors 400×

*. P<0.05圖8 腫瘤組和正常組MUC1的MODFig.8 MOD of MUC1 in different groups

*. P<0.05圖9 不同惡性級別MUC1的MODFig.9 Expression of MUC1 in different malignance grades

3 討 論

MUC1 基因定位于染色體1q21，其表達(dá)的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。在癌癥中，MUC1基因通過提高基因數(shù)量和轉(zhuǎn)錄水平，以及缺失轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)其過表達(dá)[2]。此外，MUC1在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在自發(fā)性乳腺癌和胰腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，MUC1-/-小鼠腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移要明顯遲于MUC1+/+的小鼠[6-7]。本研究中，MUC1在犬乳腺腫瘤組織相對表達(dá)量是正常乳腺組織的12.5倍，且在腫瘤的惡性分級中差異顯著，組織惡性程度越高，MUC1相對表達(dá)量越高，說明MUC1基因的異常表達(dá)同樣適用于犬乳腺腫瘤的診斷和預(yù)后評估。MUC1在正常上皮細(xì)胞表面呈極性分布，潤滑和保護(hù)底層上皮細(xì)胞免受干燥、pH值變化以及污染物和微生物的入侵[8]，在發(fā)生腫瘤時(shí)，MUC1糖基化異常會影響其在細(xì)胞表面的排列，并不斷向細(xì)胞內(nèi)聚集，可能會增強(qiáng)致癌信號[9]。本試驗(yàn)中MUC1在正常乳腺細(xì)胞頂部細(xì)胞質(zhì)中呈低表達(dá)，而在乳腺腫瘤組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，與前人研究相一致。有研究顯示，MUC1脫落的胞外結(jié)構(gòu)域(MUC1-N)可作為癌癥分級和治療評估的生物標(biāo)志物[10]，且與預(yù)后不良呈明顯的相關(guān)性[11]。本試驗(yàn)中對MUC1的IHC檢測發(fā)現(xiàn)，MUC1的MOD值隨著腫瘤惡性程度的增強(qiáng)而增加，提示MUC1在犬乳腺腫瘤組織中的表達(dá)與組織惡性程度分級有關(guān)。

4 結(jié) 論

MUC1基因和MUC1在犬乳腺腫瘤組織中高表達(dá)，且與組織惡性程度分級密切相關(guān)，可為犬乳腺腫瘤診斷和惡性程度評估提供參考，為犬乳腺腫瘤的臨床治療提供理論數(shù)據(jù)。