多靶點(diǎn)的抗菌先導(dǎo)化合物的虛擬篩選及活性研究

蔡珺珺，袁田青，楊銀萍，高 雙，宮興文

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種革蘭陰性菌，廣泛存在于不同的環(huán)境中，可以從人和動(dòng)物各種生物體中分離出來(lái)，并且對(duì)外界環(huán)境具有較高的耐受性，因此，銅綠假單胞菌可以在各種生活及醫(yī)院環(huán)境中生存，經(jīng)常導(dǎo)致人和動(dòng)物術(shù)后傷口感染，且燒傷后感染可造成死亡[1]。銅綠假單胞菌可引起皮膚病、肺炎、尿路感染、血液感染、慢性支氣管炎以及骨髓炎等嚴(yán)重疾病[2]。

大腸桿菌(Escherichiacoli)通常存在于人和動(dòng)物腸道中，可以導(dǎo)致人獸共患病，也是臨床上最容易產(chǎn)生耐藥性的革蘭陰性菌[3]。在獸醫(yī)上大腸桿菌會(huì)引起牛、豬和雞等動(dòng)物患上仔豬水腫、白痢、黃痢以及氣囊炎、腹膜炎、心包炎、卵巢炎等疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)極大損失。同時(shí)，人類(lèi)群體感染大腸桿菌會(huì)引發(fā)腹瀉、膽囊炎、尿道炎、結(jié)腸炎和敗血癥等病癥[4]。

近年來(lái)，由于抗生素在世界范圍內(nèi)的廣泛使用，銅綠假單胞菌和大腸桿菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，特別是對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重，多重耐藥菌也開(kāi)始出現(xiàn)[5]。因此，采用新技術(shù)開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物十分有必要。

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)，即黏肽合成酶，是一種對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖發(fā)揮著重要作用的蛋白，存在于細(xì)菌的細(xì)胞膜上，具有羧肽酶和轉(zhuǎn)肽酶的活性，是細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖合成過(guò)程中不可或缺的一種酶，也是青霉素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素作用的關(guān)鍵靶位[6]。按相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)分，PBPs分為高相對(duì)分子質(zhì)量黏肽合成酶(HMM)和低相對(duì)分子質(zhì)量黏肽合成酶(LMM)[7]。銅綠假單胞菌黏肽合成酶PBP3和大腸桿菌黏肽合成酶PBP1b均為HMM青霉素結(jié)合蛋白，是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖和細(xì)胞分裂過(guò)程中至關(guān)重要的蛋白，是合成細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的不可缺少的必需酶[8-9]。大腸桿菌PBP4、PBP5均為L(zhǎng)MM黏肽合成酶，這兩種PBPs不是維持細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的關(guān)鍵蛋白，但具有羧肽酶活性，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)和肽聚糖的結(jié)構(gòu)也有一定作用[10-12]。由于PBPs在肽聚糖合成中的重要作用，在新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)上，PBPs是一個(gè)十分有吸引力的靶點(diǎn)[13]。

銅綠假單胞菌和大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的主要耐藥機(jī)制之一是β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生[14-16]。青霉素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素含有特殊結(jié)構(gòu)β-內(nèi)酰胺環(huán)，通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁PBPs的合成，使細(xì)菌裂解死亡來(lái)發(fā)揮抗菌作用，而β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞，進(jìn)而使抗生素失效，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[17-18]。此外，抗菌藥物作用靶位的改變，即PBPs發(fā)生改變，以及細(xì)菌外膜滲透性降低和外膜主動(dòng)泵出系統(tǒng)也會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

先導(dǎo)化合物是指本身具有一定活性，但同時(shí)由于較大的毒性或活性仍然有待提高，需要采取一定的措施對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改善和優(yōu)化再進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用的藥物[19]。隨著生物學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行虛擬篩選從而發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物已成為新藥研發(fā)的一種常用方法。虛擬篩選是利用高性能計(jì)算對(duì)大型化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，從而選擇出可能的候選藥物的一種技術(shù)[20-21]。在虛擬篩選的過(guò)程中，使用分子對(duì)接的方法找到具有活性的化合物是一種常用的手段。分子對(duì)接就是將大量的小分子依次放入到受體蛋白的活性位點(diǎn)，按照形狀互補(bǔ)和能量互補(bǔ)等原則不斷調(diào)整和優(yōu)化受體和配體的位置以及自身構(gòu)象，使二者在結(jié)構(gòu)、空間和電荷上均達(dá)到最佳的匹配模式[22]。對(duì)比高通量的篩選技術(shù)，采用虛擬篩選不僅成本低，可行性更高，而且可以在更短時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的有潛力的先導(dǎo)化合物[23]。

根據(jù)青霉素結(jié)合蛋白與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的結(jié)合原理，本研究選擇銅綠假單胞菌PBP3以及大腸桿菌PBP1b、PBP4、PBP5為靶點(diǎn)，采用分子對(duì)接技術(shù)在數(shù)目龐大的小分子化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行虛擬篩選，以期望找到與靶點(diǎn)親和力高的先導(dǎo)化合物。之后，通過(guò)有機(jī)合成制備先導(dǎo)化合物，并驗(yàn)證其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DOCK程序、ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)和Chimera程序 DOCK程序由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Kuntz等開(kāi)發(fā)，本研究選用DOCK6.5版本。ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)為篩選所用的小分子化合物的來(lái)源(http://zinc.docking.orghttp://zinc.docking.org)，選擇其中的drug-like子數(shù)據(jù)庫(kù)，化合物數(shù)量約580萬(wàn)。Chimera程序由加州大學(xué)舊金山分校建立，是一個(gè)交互式分子模型顯示和分析程序，本研究中主要用于處理受體和配體以及顯示對(duì)接結(jié)果。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC10104、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC44102來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)來(lái)自浙江工商大學(xué)食品與生物學(xué)院；銅綠假單胞菌PBP3和大腸桿菌PBP1b的基因工程菌株為本實(shí)驗(yàn)室所保存；質(zhì)控菌株為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC44102；MH和LB肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 主要試劑與設(shè)備

三聚氯氰(2，4，6-三氯-1，3，5三嗪)、N-N二異丙基乙胺(DIPEA)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技有限公司；甘氨酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；丙酮購(gòu)于浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯購(gòu)于無(wú)錫市展望化工試劑股份有限公司；鹽酸、石油醚、氫氧化鈉購(gòu)于天津市永大試劑公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA RV10購(gòu)于德國(guó)艾卡公司，JJ-CT-IFD潔凈工作臺(tái)(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司)，LDEX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng))。

1.3 虛擬篩選

1.3.1 生成受體和配體文件 以銅綠假單胞菌黏肽合成酶PBP3為例，從protein data bank網(wǎng)站(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)上搜索并下載3PBQ文件(3PBQ.pdb)，即銅綠假單胞菌青霉素結(jié)合蛋白PBP3與亞胺培南結(jié)合的復(fù)合物(亞胺培南結(jié)合在PBP3活性位點(diǎn)上)。運(yùn)行Chimera程序，刪除該復(fù)合物中的配體亞胺培南，保留受體PBP3，再對(duì)受體進(jìn)行去溶劑、加氫、加電荷以及修改錯(cuò)誤的氨基酸命名等操作，并保存為mol2格式的受體文件。再對(duì)受體進(jìn)行去氫，保存其pdb文件。然后，再將該復(fù)合物刪除受體PBP3，僅保留配體亞胺培南，同樣進(jìn)行加氫和加電荷等處理，保存為mol2格式文件。大腸桿菌黏肽合成酶PBP1b、PBP4、PBP5依上述方法分別下載3FWM、2EXA、3MZE文件，復(fù)合物中所含配體分別為默諾霉素、法羅培南和頭孢西丁。對(duì)這些受體和配體如上處理，然后保存為相應(yīng)文件。

1.3.2 球集的生成 受體分子表面分布著很多凹槽，這些凹槽投射出的陰影稱(chēng)之為球集。選擇距離亞胺培南、默諾霉素、法羅培南和頭孢西丁等配體結(jié)合位置半徑5 ?范圍內(nèi)的球集作為對(duì)接時(shí)的靶點(diǎn)，對(duì)不符合要求的球集進(jìn)行刪除處理，并生成盒子文件，用于約束后續(xù)分子對(duì)接中配體的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3.3 Grid文件的生成 在分子對(duì)接時(shí)，需要對(duì)受體和配體之間的相互作用能及結(jié)合能進(jìn)行高性能計(jì)算，即進(jìn)行dock的能量打分，包括對(duì)分子間靜電引力，氫鍵作用、疏水作用和范德華力等相互作用能進(jìn)行評(píng)價(jià)。在本階段生成打分用的Grid文件。

1.3.4 分子對(duì)接 分子對(duì)接就是將小分子化合物逐個(gè)放入到受體蛋白中的靶點(diǎn)部位，按照形狀互補(bǔ)和能量互補(bǔ)等原則不斷優(yōu)化受體和配體的構(gòu)象，使二者達(dá)到最佳的匹配模式。在本研究中，是將化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中的小分子分別與銅綠假單胞菌PBP3、大腸桿菌PBP1b、PBP4和PBP5對(duì)接，對(duì)接部位即前面選擇的靶點(diǎn)球集，并進(jìn)行位置和構(gòu)象的不斷調(diào)整和能量打分。

1.3.5 第一輪篩選 第一輪篩選中，受體的設(shè)置選擇剛性，配體選擇柔性，并用Grid score對(duì)受體和配體之間的親和力進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)接過(guò)程中受體與數(shù)據(jù)庫(kù)中的每個(gè)小分子都會(huì)獲得最佳的空間匹配模式和最好的結(jié)合構(gòu)象，Grid score會(huì)按照分?jǐn)?shù)由大到小的順序排列，選取其中分?jǐn)?shù)好并且結(jié)構(gòu)也比較好的化合物進(jìn)入第二輪篩選。

1.3.6 第二輪篩選 第二輪篩選使用Amber score，對(duì)上一輪篩選得到的得分較高的每個(gè)小分子化合物進(jìn)行更細(xì)致的打分，在這一步中，受體也被設(shè)置為柔性，MD與能力優(yōu)化等參數(shù)均使用默認(rèn)值。結(jié)束計(jì)算后，按照Amber score分?jǐn)?shù)大小進(jìn)行排列，從中選取分?jǐn)?shù)較好并且結(jié)構(gòu)新穎的化合物進(jìn)行有機(jī)合成。

1.4 合成先導(dǎo)化合物

1.4.1 2，4-二氯-6-哌啶基-1，3，5-均三嗪的合成[24]取三聚氯氰5.0 g(27.10 mmol)于100 mL二氯甲烷中攪拌溶解，再取50 mL二氯甲烷，加入2.68 mL(27.12 mmol)哌啶和5.2 mL(29.85 mmol)DIPEA，在0 ℃條件下將溶有三聚氯氰的二氯甲烷于1 h內(nèi)逐滴加入其中，同時(shí)維持整個(gè)反應(yīng)在0 ℃下進(jìn)行，2 h后結(jié)束反應(yīng)，溶液用濃鹽酸(2×100 mL)、水(100 mL)分別進(jìn)行水洗，分層過(guò)濾，取二氯甲烷層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除二氯甲烷，干燥得到淡黃色固體粉末，產(chǎn)率81%。硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=9∶1)。

1.4.2 2，4-二甘氨酸-6-哌啶基-1，3，5-均三嗪的合成[25]取上一步合成得到的2，4-二氯-6-哌啶基-1，3，5-均三嗪粉末4.66 g(20 mmol)溶解于丙酮中，再取3.45 g(46 mmol)甘氨酸和6.6 g(165 mmol)NaOH溶解于50 mL水中，于1 h內(nèi)在70 ℃條件下逐滴加入到丙酮溶液中，加熱4 h后冷卻到室溫，并在室溫下攪拌1 h，結(jié)束后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2左右，將裝置移到0～5 ℃的冰浴中保持20 min，析出固體，過(guò)濾，10 mL蒸餾水洗3次，10 mL丙酮洗2次 ，待丙酮揮發(fā)后置于70 ℃烘箱烘干，干燥純化后得到白色固體粉末，產(chǎn)率62%。硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=5∶1；二氯甲烷∶甲醇=1∶3)。

反應(yīng)流程如圖1所示。

圖1 先導(dǎo)化合物合成流程圖Fig.1 Synthesis flow chart of lead compound

1.5 抑菌試驗(yàn)

1.5.1 菌種的活化與制備 將P.Aeruginosa、E.coli、B.subtilis、L.monocytogenes以及S.aureus加入到MH肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)過(guò)夜后稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫?在良好的光照條件下將試管與0.5麥?zhǔn)媳葷峁芡瑫r(shí)置于畫(huà)有黑色平行線(xiàn)條的白色紙上進(jìn)行對(duì)比)，菌懸液濃度約為1×108CFU·mL-1，待用。

1.5.2 不同濃度藥物的制備 將先導(dǎo)化合物、磺胺嘧啶分別用蒸餾水和DMSO溶解，配制成2 mg·mL-1的溶液，其中，向溶解情況不太好的溶液中加入0.2%的吐溫80助溶；將氨芐青霉素鈉用蒸餾水配制成0.8 mg·mL-1的溶液，待用。

1.5.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 將配制好的先導(dǎo)化合物和磺胺嘧啶溶液分別在試管中用MH肉湯稀釋為0、150、175、200、225、250和500 μg·mL-1，將氨芐青霉素鈉同樣用MH肉湯稀釋為0、12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，每管加入100 μL菌液，試驗(yàn)中設(shè)空白對(duì)照組，加10 mL的MH肉湯，不加菌懸液，將試管置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中12 h培養(yǎng)，每種供試菌做三組平行試驗(yàn)。

1.6 先導(dǎo)化合物與PBPs的結(jié)合

參照喻召武[26]的方法，將先導(dǎo)化合物攜帶的羧基轉(zhuǎn)化為酰胺基，然后將轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物與熒光染料NBD-Cl進(jìn)行混合，制成熒光探針。以本實(shí)驗(yàn)室保存的PBP3和PBP1b基因工程菌株來(lái)制備PBP3和PBP1b蛋白，參照安艷冬[27]的方法誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，之后，高速離心，棄上清，菌體沉淀以50 mmoL·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)重懸，混勻后于超聲破碎儀中破碎(超聲時(shí)間3 s，間隔3 s，共100次，超聲功率400 w)，結(jié)束后在4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液4 ℃保存。再取100 μL上清液加入200 μL熒光探針，并置于37 ℃恒溫?fù)u床中孵育2 h，使蛋白與熒光探針充分接觸，然后取二者混合物100 μL并加入100 μL上樣緩沖液，煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，紫外光下觀(guān)察熒光條帶。

2 結(jié) 果

2.1 受體與配體文件

以銅綠假單胞菌PBP3為例，從protein data bank網(wǎng)站下載銅綠假單胞菌黏肽合成酶PBP3與亞胺培南復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(圖2a)，對(duì)復(fù)合物進(jìn)行除配體、去溶劑、加氫、加電荷等處理，得到單獨(dú)的受體蛋白PBP3文件。然后進(jìn)行配體準(zhǔn)備工作，刪除受體、加氫和加電荷等處理，得到配體文件。大腸桿菌黏肽合成酶的晶體結(jié)構(gòu)PBP1b(圖2b)、PBP4(圖2c)、PBP5(圖2d)亦如上處理。

a、b、c、d展示了受體蛋白P. aeruginosa PBP3和E. coli PBP1b、PBP4、PBP5Panels a, b, c and d represent the profiles of P. aeruginosa PBP3 and E. coli PBP1b, PBP4 and PBP5圖2 銅綠假單胞菌PBP3及大腸桿菌PBP1b、PBP4、PBP5的晶體結(jié)構(gòu)和靶點(diǎn)球集Fig.2 Crystal structures and binding spheres of P. aeruginosa PBP3 and E. coli PBP1b, PBP4 and PBP5

2.2 生成球集

以受體上原有配體的位置為基點(diǎn)，比如，以結(jié)合在銅綠假單胞菌PBP3上的亞胺培南的位置為基點(diǎn)，在sphgen程序中將篩選的球集范圍定為5?，篩選出21個(gè)球集作為對(duì)接時(shí)的靶點(diǎn)，同時(shí)在球集5?的范圍內(nèi)設(shè)置一個(gè)盒子，以約束對(duì)接時(shí)的結(jié)合位點(diǎn)范圍。大腸桿菌黏肽合成酶PBP1b、PBP4、PBP5均按上述方法處理，球集及盒子情況見(jiàn)圖2。

2.3 第一輪篩選

在第一輪篩選中，使用Grid score對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的小分子化合物與受體蛋白的親和力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，篩選出得分在-125.6 kJ·mol-1(-30 kcal·mol-1)以下的約6萬(wàn)個(gè)小分子化合物，進(jìn)入第二輪篩選。

2.4 第二輪篩選

使用Amber score作為第二輪篩選的打分方法，對(duì)上一步篩選得到的化合物進(jìn)一步打分。Amber score的計(jì)算速度較慢，但優(yōu)點(diǎn)是受體和配體均被設(shè)置為柔性，即可以自由變換本身構(gòu)象，因而，二者可以經(jīng)不斷的改變而使結(jié)合更加契合和精準(zhǔn)，所以Amber score的打分更加全面和精細(xì)。計(jì)算結(jié)束后，篩選出得分在-83.7 kJ·mol-1(-20 kcal·mol-1)以下的化合物約200個(gè)。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)很多化合物結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，難以合成。所以，選取了其中1種得分較高、結(jié)構(gòu)新穎并且易于合成的先導(dǎo)化合物用于后續(xù)研究，其得分情況如表1所示。

表1篩選出的先導(dǎo)化合物的得分

Table1Scoringofselectedleadcompounds

受體蛋白R(shí)eceptor protein得分 ScoreGrid scoreAmber score銅綠假單胞菌PBP3PBP3 of P. aeruginosa-48.592 82-31.429 01大腸桿菌PBP1bPBP1b of E. coli-53.470 13-21.943 18大腸桿菌PBP4PBP4 of E. coli-50.250 33-37.798 23大腸桿菌PBP5PBP5 of E. coli-58.723 83-35.642 69

從表1可以看出，在虛擬篩選過(guò)程中，化合物經(jīng)第二輪篩選Amber score打分后獲得較高的分?jǐn)?shù)時(shí)，其在第一輪初篩時(shí)獲得的Grid score的分?jǐn)?shù)不一定會(huì)很高。同樣的，在Grid score打分階段獲得高分的小分子化合物，當(dāng)進(jìn)入第二輪篩選經(jīng)Amber score打分后，得到的最終分?jǐn)?shù)也不一定會(huì)很高。這是由于在進(jìn)行第二輪虛擬篩選時(shí)，配體和受體均為柔性，從而使二者的結(jié)合更加精準(zhǔn)。而在第一輪初篩時(shí)，受體的設(shè)置是剛性，即在對(duì)接中受體的構(gòu)象不允許發(fā)生變化，只有配體可以自由變化其構(gòu)象，因而Grid score和Amber score的打分情況并不能完全吻合。雖然Grid score的打分不夠精確，但是其運(yùn)算速度快，可以快速剔除形態(tài)上和受體不匹配的化合物，大大提高了篩選的效率。而第二輪的Amber score打分精確，保證了篩選的精度。因此，結(jié)合Grid score和Amber score兩輪打分，就可以從大量候選化合物中快速篩選出有潛力的先導(dǎo)化合物。

2.5 先導(dǎo)化合物與受體蛋白的結(jié)合

使用chimera軟件對(duì)先導(dǎo)化合物和受體蛋白PBP3、PBP1b、PBP4、PBP5的結(jié)合情況進(jìn)行觀(guān)察與分析，結(jié)果如圖3所示。

在虛擬篩選階段下載pdb文件時(shí)，選擇的分別是PBP3與亞胺培南((5R,6S)-6-[(1R)-1-羥乙基]-3-[[2-[(亞氨基甲基)氨基]乙基]硫代]-7-氧代-1-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸)、PBP1b與默諾霉素、PBP4與法羅培南([5R-[3(R^^)，5Α，6Α(R^^)]]-6-(1-羥基乙基)-7-氧-3-(四氫-2-呋哺基)-4-硫-1-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸)以及PBP5與頭孢西丁(3-氨基甲?；跫谆?7-甲氧基-7-(2-噻吩乙酰胺基)-8-氧代-5-硫-1-雜氮雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸)的復(fù)合物文件，這些藥物本身就結(jié)合在相應(yīng)蛋白的活性位點(diǎn)上，在虛擬篩選時(shí)只是去除這些藥物，然后將化合物放入藥物原本的結(jié)合位置上。如圖3所示，可以看出篩選出的先導(dǎo)化合物均結(jié)合在受體蛋白銅綠假單胞菌PBP3、大腸桿菌PBP1b、PBP4和PBP5的凹槽處，即相應(yīng)的活性位點(diǎn)上，而且受體與配體之間的形態(tài)匹配比較好。

a、b、c、d展示了受體蛋白P. aeruginosa PBP3和E. coli PBP1b、PBP4、PBP5Panels a, b, c and d represent the receptor protein of P. aeruginosa PBP3 and E. coli PBP1b, PBP4 and PBP5圖3 篩選出的先導(dǎo)化合物與受體的結(jié)合情況Fig.3 Binding of the lead compound with the receptors

此外，采用ligplot對(duì)受體蛋白和先導(dǎo)化合物之間的相互作用進(jìn)行了進(jìn)一步分析。從圖4可以看到，篩選出的這種先導(dǎo)化合物與受體之間普遍存在較多數(shù)目的疏水相互作用和氫鍵作用。其中，先導(dǎo)化合物與銅綠假單胞菌PBP3之間有4個(gè)氫鍵、2個(gè)疏水相互作用；與大腸桿菌PBP1b和PBP4之間有2個(gè)氫鍵、1個(gè)疏水作用以及4個(gè)氫鍵、2個(gè)疏水作用；與大腸桿菌PBP5之間相互作用最多，分別為4個(gè)氫鍵作用和6個(gè)疏水相互作用。這些較多的相互作用表明先導(dǎo)化合物與受體之間具有較高的親和力。

2.6 先導(dǎo)化合物的合成

根據(jù)虛擬篩選的結(jié)果，選擇化合物ZINC00053282進(jìn)行了有機(jī)合成(圖1)。之后，將先導(dǎo)化合物溶于氘帶重水，并加入2%氫氧化鈉，通過(guò)核磁驗(yàn)證了結(jié)構(gòu)，碳譜和氫譜的結(jié)果分別如圖5、6所示。

2.7 抑菌試驗(yàn)

分別測(cè)定了合成的先導(dǎo)化合物、磺胺嘧啶和氨芐青霉素鈉對(duì)P.aeruginosa、E.coli、B.subtilis、L.monocytogenes以及S.aureus的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果表明，合成的先導(dǎo)化合物對(duì)5種供試菌均具有抑菌活性，抑菌濃度在175～250 μg·mL-1之間，這說(shuō)明合成出的先導(dǎo)化合物對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有抑菌活性，屬于廣譜抗菌作用。同時(shí)，從表中可以看出先導(dǎo)化合物對(duì)P.aeruginosa和E.coli的抑菌效果比B.subtilis、L.monocytogenes和S.aureus的抑菌效果要好，分別為200和175 μg·mL-1，其中對(duì)S.aureus的抑菌活性最低，為250 μg·mL-1，對(duì)B.subtilis和L.monocytogenes的最小抑菌濃度均為225 μg·mL-1，這說(shuō)明先導(dǎo)化合物對(duì)革蘭陰性菌的抑菌活性要高于革蘭陽(yáng)性菌，其原因可能是我們?cè)谔摂M篩選過(guò)程中選擇的靶點(diǎn)是革蘭陰性菌的青霉素結(jié)合蛋白，也有可能是由于篩選出的先導(dǎo)化合物對(duì)革蘭陰性菌的青霉素結(jié)合蛋白親和力更高。此外，從表2中可以看出，作為廣譜抗菌藥的磺胺嘧啶對(duì)5種菌的最小抑菌濃度均為500 μg·mL-1，說(shuō)明先導(dǎo)化合物的廣譜抑菌活性比磺胺嘧啶更高。雖然先導(dǎo)化合物抑菌效果不及氨芐青霉素鈉(12.5 μg·mL-1)，但是從結(jié)構(gòu)上看，先導(dǎo)化合物不具有β-內(nèi)酰胺環(huán)，而當(dāng)前由于抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)被β-內(nèi)酰胺酶水解，從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題層出不窮，而我們合成的先導(dǎo)化合物沒(méi)有這種結(jié)構(gòu)，不會(huì)被β-內(nèi)酰胺酶所水解，所以，可以考慮將這種先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，進(jìn)一步提高活性，用于耐藥菌的治療。

a、b、c、d展示了受體蛋白P. aeruginosa PBP3和E. coli PBP1b、PBP4、PBP5Panels a, b, c and d represent the receptor protein of P. aeruginosa PBP3 and E. coli PBP1b, PBP4 and PBP5圖4 篩選出的先導(dǎo)化合物與受體的相互作用Fig.4 The interactions between the lead compound and the receptors

13C NMR (126 MHz, D2O) δ 178.33 (s), 165.75 (s), 163.77 (s), 62.32 (s), 44.30 (s), 25.20 (s), 24.13 (s)圖5 先導(dǎo)化合物ZINC00053282碳譜圖Fig.5 13C NMR of lead compound ZINC00053282

1H NMR (500 MHz, D2O) δ 3.69 (s, 4H), 3.48 (s, 4H), 1.47 (s, 2H), 1.38 (s, 4H)圖6 先導(dǎo)化合物ZINC00053282氫譜圖Fig.6 1H NMR of lead compound ZINC00053282

表2先導(dǎo)化合物的最小抑菌濃度

Table2Minimuminhibitoryconcentrationofleadcompounds

μg·mL-1

以最小抑菌濃度(MIC)作為衡量樣品抗菌活性的標(biāo)準(zhǔn)?！?”表示沒(méi)有抑菌濃度，即不具備抗菌活性

Minimum inhibitory concentration (MIC) was used as the standard for measuring the antibacterial activity of samples. "-" indicates no inhibitory concentration, that is, it does not possess antibacterial activity

2.8 先導(dǎo)化合物與PBPs的結(jié)合

目前，針對(duì)PBPs的藥物開(kāi)發(fā)通常都是通過(guò)探針的結(jié)合來(lái)推測(cè)作用機(jī)制。在本研究中，先將先導(dǎo)化合物和熒光試劑結(jié)合，制成熒光探針，然后與PBP3和PBP1b蛋白反應(yīng)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，得到的電泳圖及熒光圖分別如圖7和8所示。銅綠假單胞菌PBP3和大腸桿菌PBP1b的理論相對(duì)分子質(zhì)量分別為60和80 ku，與圖中所示一致。圖7中1～3為蛋白與熒光探針作用后的電泳條帶，4為Marker蛋白，其中，對(duì)比熒光圖可以看到，1～3泳道的條帶在紫外下可以看到三條與之位置相對(duì)應(yīng)的熒光條帶，這證明先導(dǎo)化合物已經(jīng)與PBP3相結(jié)合。

泳道1、2和3為蛋白與熒光探針作用后的電泳條帶；4為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(ku)Lane 1-3 represent electrophoretogram of PBP3 complex with fluorescent probe; Lane 4 represent marker圖7 熒光探針與PBP3結(jié)合后的電泳圖及熒光圖Fig.7 The electrophoretogram and fluorography of PBP3 combined with fluorescent probe

同樣的，圖8中1、2為蛋白與熒光探針作用后的電泳圖，3為Mark蛋白，其中，泳道1、2中的條帶與紫外下熒光圖中兩條熒光條帶的位置相對(duì)應(yīng)，同樣證明先導(dǎo)化合物已與PBP1b結(jié)合，這說(shuō)明篩選出的先導(dǎo)化合物可能是通過(guò)與PBP蛋白相結(jié)合，抑制其活性而發(fā)揮抗菌作用的。

泳道1、2為蛋白與熒光探針作用后的電泳條帶；3為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(ku)Lane 1-2 represent electrophoretogram of PBP1b complex with fluorescent probe; Lane 3 represent marker圖8 熒光探針與PBP1b結(jié)合后的電泳圖及熒光圖Fig.8 The electrophoretogram and fluorography of PBP1b combined with fluorescent probe

3 討 論

虛擬篩選是一種基于生物大分子的特定靶標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助篩選，以找到具有活性的先導(dǎo)化合物的方法，當(dāng)前虛擬篩選已經(jīng)成為新藥開(kāi)發(fā)的重要手段，可以從幾百萬(wàn)個(gè)分子中快速找出潛在的與靶蛋白具有相互作用的目標(biāo)分子，大大地縮短了研究時(shí)間，提高了篩選效率。利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)行藥物的大規(guī)模虛擬篩選，比傳統(tǒng)的高通量篩選在速度、效率以及精準(zhǔn)度上更加具有優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為替代高通量篩選的主要方法。目前，虛擬篩選的方法已取得了非常多的成就，比如，1999年用計(jì)算機(jī)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了3個(gè)活性較高的用于受體Muscarinic M3的拮抗劑分子[28]；2002年通過(guò)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了多種能夠抑制人碳酸酐酶的活性物質(zhì)[29]。近年來(lái)，虛擬篩選在對(duì)阻斷HIV Nef蛋白從而開(kāi)發(fā)新型HIV藥物[30]，發(fā)現(xiàn)能夠抑制神經(jīng)氨酸酶流感病毒的藥物[28]，以及開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物[31]等方面均取得了重大的進(jìn)展。

本研究針對(duì)當(dāng)前人類(lèi)和獸醫(yī)臨床上細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性問(wèn)題，選擇銅綠假單胞菌PBP3和大腸桿菌PBP1b、PBP4和PBP5為靶點(diǎn)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選，并對(duì)篩選出的編號(hào)為ZINC00053282的先導(dǎo)化合物進(jìn)行了有機(jī)合成與抑菌活性研究，結(jié)果證明這種先導(dǎo)化合物對(duì)革蘭陰性和陽(yáng)性菌均有較好的抗菌作用，但對(duì)銅綠假單胞菌和大腸桿菌(175和200 μg·mL-1)的抑菌效果要比枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌(225和250 μg·mL-1)更好，其原因可能是篩選的靶點(diǎn)來(lái)自于銅綠假單胞菌和大腸桿菌，也有可能是這種先導(dǎo)化合物相比革蘭陽(yáng)性菌，對(duì)革蘭陰性菌更具有親和力。

當(dāng)然，作為先導(dǎo)化合物，目前的抗菌活性并不是很強(qiáng)，但是其結(jié)構(gòu)新穎，與已有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)等抗菌藥物結(jié)構(gòu)不同。在后續(xù)的研究中，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造，有望開(kāi)發(fā)成為新型抗菌藥物，用于耐藥菌的治療。

4 結(jié) 論

根據(jù)銅綠假單胞菌和大腸桿菌PBPs與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的作用機(jī)制，以銅綠假單胞菌PBP3和大腸桿菌PBP1b、PBP4和PBP5等4個(gè)PBPs作為靶點(diǎn)，選擇含有大量化合物的ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行虛擬篩選，以期找到具有高親和力的、能夠抑制PBPs與底物結(jié)合，從而使細(xì)菌細(xì)胞壁無(wú)法合成而死亡的先導(dǎo)化合物。通過(guò)第一輪篩選，選擇分值低于-125.6 kJ·mol-1的化合物，再以Amber score進(jìn)行第二輪篩選，篩選出得分低于-83.7 kJ·mol-1的化合物約200個(gè)，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，選擇編號(hào)為ZINC0053282的化合物進(jìn)行了有機(jī)合成。經(jīng)過(guò)核磁共振波譜儀的碳譜和氫譜驗(yàn)證，表明合成的化合物結(jié)構(gòu)正確。抑菌試驗(yàn)的結(jié)果表明，合成的先導(dǎo)化合物抑菌效果較好，對(duì)革蘭陰性和陽(yáng)性菌都有效。由于該先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)新穎，沒(méi)有β-內(nèi)酰胺環(huán)，不會(huì)被β-內(nèi)酰胺酶所降解，經(jīng)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，可以用于對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的細(xì)菌的治療。