豬繁殖與呼吸綜合征弱毒活疫苗免疫豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備及其活性分析

郭海勇，袁洪興，孫泰然，曹 靜，宋勤葉*，李潭清，逯紀成

(1.吉林師范大學 生命科學學院，四平 136000；2.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院 河北省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，保定 071001； 3.河北省保定市動物疫病預防控制中心，保定 071000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是導致母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎兒、不孕等繁殖障礙，哺乳仔豬呼吸系統(tǒng)疾病、大量死亡，生長豬呼吸道疾病頻發(fā)、成活率降低的重要傳染病，嚴重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1-4]。PRRS于1987年首次在北美暴發(fā)流行[5]，1996年我國首次報道此病并分離到病毒[6]，2006年由PRRSV變異株引起的高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)在國內(nèi)各地豬場廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[1,7]。

PRRSV主要感染宿主的單核/巨噬細胞，損害機體免疫功能，引起Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和IFN-γ的表達水平下降[8-12]。此外，PRRSV雖然在感染早期可以誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，但是該抗體無抑制或中和病毒作用，而直到感染4周后才能夠檢測到高親和力的病毒中和抗體[2,13]。PRRSV感染引起的免疫功能抑制和低水平中和抗體導致病毒在宿主體內(nèi)持續(xù)性存在，出現(xiàn)抗體依賴性增強作用(antibody-dependent enhancement, ADE)感染免疫特征[2-4,13-14]。轉(zhuǎn)移因子(transfer factor，TF)于1954年首次發(fā)現(xiàn)和報道，是具有免疫活性的T淋巴細胞產(chǎn)生的一類可透析的小分子物質(zhì)，其相對分子質(zhì)量<5 ku，是由核酸和多肽相連而成的雜合分子[15-16]。TF能特異性地將供體的細胞免疫功能轉(zhuǎn)移給受體，具有激發(fā)免疫細胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強機體特異性和非特異性細胞免疫功能等作用，并且無熱原和抗原性，不引起過敏反應，無明顯毒副作用和種屬特異性，其對于惡性腫瘤性疾病、免疫缺陷性疾病以及病毒、細菌和寄生蟲等引起的感染性疾病具有良好輔助治療和預防效果[15-18]。李士學等[19]從PRRSV滅活疫苗免疫豬和非免疫豬的脾分別提取了TF，發(fā)現(xiàn)從免疫豬提取的TF對小鼠外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte，PBLC)轉(zhuǎn)化能力的增強作用更高。但該研究未報道所制備轉(zhuǎn)移因子的成分，也未對豬免疫細胞的增強作用進行深入研究。PRRSV侵害機體免疫細胞，引起機體免疫功能抑制，且目前PRRSV疫苗免疫效果不理想，研發(fā)能夠改善機體免疫力和增強疫苗免疫效果的免疫增強劑具有現(xiàn)實意義。TF可以調(diào)節(jié)和改善機體細胞免疫功能，是一種應用前景廣闊的免疫調(diào)節(jié)劑。本研究從PRRSV弱毒活疫苗免疫豬的脾中提取TF，分析其成分及免疫活性，旨在為改善PRRSV疫苗的免疫效果和新型免疫增強劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 疫苗與主要試劑

PRRSV弱毒活疫苗，購自吉林省元亨生物技術(shù)有限公司；淋巴細胞分離液(密度為1.077 g·mL-1)，購自北京Solarbio公司；無酚紅RPMI 1640細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)液、噻唑藍(MTT)及 ConA，均為美國Promega 公司產(chǎn)品。PRRSV抗體檢測試劑盒，為美國IDEXX公司產(chǎn)品。

1.2 動物

4周齡和3月齡健康非免疫豬(杜洛克×長白× 大約克夏三元雜交)，購自河北保定某規(guī)模化豬場。6～8周齡SPF BALB/c小鼠，購自河北醫(yī)科大學。

1.3 TF的制備

給2頭3月齡豬肌內(nèi)注射PRRSV弱毒疫苗，以每頭豬3頭份劑量連續(xù)接種4次；第4次免疫10 d 后，采取前腔靜脈血，分離血清；按照ELISA檢測試劑盒說明，檢測PRRSV抗體。當特異抗體水平合格(S/N值在1.5左右)，用2.5%戊巴比妥鈉麻醉后，無菌采取豬的脾，去除被膜和結(jié)締組織，用無菌生理鹽水沖洗3次，稱重，剪碎；加入適量無菌生理鹽水，制成勻漿；經(jīng)凍融—透析后，收集透析外液，過濾除菌后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 理化性質(zhì)及主要成分檢測

觀察TF的顏色及有無沉淀物產(chǎn)生，嗅其氣味，測定pH值。應用磺基水楊酸法，檢測TF中是否含有蛋白質(zhì)；通過茚三酮反應和硝酸—鉬酸銨試驗，分別檢測TF中的氨基酸和核酸成分；用紫外分光光度計測量波長為260 nm和280 nm的光密度吸收(OD)值，計算OD260 nm/OD280 nm值，當OD260 nm/OD280 nm>2.0時，表示制備的TF合格。

1.5 氨基酸種類及含量的測定

取1 mL樣品加入9 mL 6.0 mol·L-1的鹽酸，110 ℃下水解14 h，冷卻至室溫；取水解液5 mL真空抽干，加入0.1 mol·L-1的鹽酸1.0 mL溶解后，經(jīng)過氨基酸衍生，用高效液相色譜儀(Agilent 1200)檢測TF中的氨基酸組成及其含量。

1.6 免疫活性檢測

1.6.1 巨噬細胞吞噬率的檢測 取BALB/c小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組6只。試驗組每只小鼠腹腔注射1 mL TF；對照組每只小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。每隔24 h注射一次，連續(xù)注射5次。參照文獻[20]所述方法，采取腹腔液，滴于載玻片上，經(jīng)姬姆薩染色后，顯微鏡下計數(shù)吞噬紅細胞的巨噬細胞數(shù)，計算吞噬率。吞噬率(%)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/200個巨噬細胞×100%。

1.6.2 小鼠外周血淋巴細胞增殖試驗 采集3只6～8 周齡BALB/c小鼠眼球血，分離PBLC，用適量含10%小牛血清無酚紅的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液懸浮。經(jīng)1%臺盼藍染色，顯微鏡下檢測PBLC的活性>95%時，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為4×106個·mL-1；將100 μL細胞懸液加到96孔細胞培養(yǎng)板的相應各孔內(nèi)，每個樣品重復3孔，每孔用2.78 μg TF刺激，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。同時設(shè)立ConA(終濃度為10 μg·孔-1)陽性和生理鹽水陰性對照孔。每孔加入10 μL MTT溶液(5 μg·μL-1)， 混勻，于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)4 h；每孔加入100 μL 10% SDS-0.01 mol·L-1鹽酸，混勻后于37 ℃作用30 min；消除孔內(nèi)氣泡，測定OD570 nm光密度值，計算各組淋巴細胞的刺激指數(shù)(stimulating index，SI)。SI=(刺激孔OD值-營養(yǎng)液對照孔的OD值)/(不刺激的陰性對照孔的OD值-營養(yǎng)液對照孔的OD值)。

1.6.3 PRRSV弱毒疫苗-TF免疫豬外周血淋巴細胞增殖試驗 將4 周齡健康仔豬隨機分為A、B、C組，每組3頭。A組：每頭豬左、右側(cè)耳后分別肌內(nèi)注射1頭份PRRSV弱毒疫苗和1 mL TF；B組：每頭豬注射1頭份PRRSV弱毒疫苗和1 mL TF的混合液；C組：每頭豬注射1頭份PRRSV弱毒疫苗和1 mL生理鹽水混合液。免疫前0 d和免疫后20 d ，經(jīng)前腔靜脈采血，分離外周血淋巴細胞，應用MTT法檢測淋巴細胞增殖活性。MTT試驗方法及SI的計算方法同“1.6.2”。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用 SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，用成對樣本T-test方法檢驗不同組的吞噬細胞吞噬率以及小鼠外周血淋巴細胞SI的差異，用Two-way ANOVA方法檢驗不同組的豬外周血淋巴細胞SI的差異。當P<0. 05 時，差異顯著；P<0. 01 時，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 理化性質(zhì)及主要成分

制備的TF呈淡黃色的澄清液體，有微弱的腥味，pH值為6.44；與20%磺基水楊酸反應無沉淀生成，與茚三酮反應溶液呈藍紫色，說明TF溶液中無蛋白質(zhì)成分，但含有氨基酸；與硝酸-鉬酸銨反應有黃色沉淀生成，生理鹽水對照無沉淀生成，表明TF溶液內(nèi)含有PO43-。紫外分光光度計測定的OD260 nm和OD280 nm的平均值分別為0.430和0.155，OD260 nm/OD280 nm值為2.77，核酸的含量為21.5 μg·mL-1。

2.2 氨基酸種類及其含量

經(jīng)高效液相色譜儀分析可知，制備的TF含有18種氨基酸(圖1和表1)。其中谷氨酸的含量最高，為0.642 mg·mL-1，其次為非蛋白氨基酸——牛磺酸，含量為0.298 mg·mL-1，此后依次為甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸等，每毫升TF中含氨基酸總量為3.479 mg。

圖1 TF氨基酸組成的高效液相色譜分析Fig.1 The amino acid composition analysis of TF by high performance liquid chromatography

2.3 TF可以增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性

顯微鏡下計數(shù)200個細胞，計算腹腔巨噬細胞對雞紅細胞吞噬率。注射TF組的小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率為54.48%，注射生理鹽水對照組的吞噬率為39.73%，兩組間差異極顯著(P<0.01) (圖2)，表明TF能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性。

2.4 TF能夠提高小鼠PBLC的增殖能力

用制備的TF和ConA分別刺激小鼠PBLC 48 h后，通過MTT法檢測各組淋巴細胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)TF和ConA刺激組的PBLC增殖的SI均顯著高于陰性對照組的SI (P<0.05)，并且TF刺激細胞的增殖活性顯著高于ConA刺激細胞(P<0.05)(圖3)。該結(jié)果表明TF能夠顯著提高PBLC的增殖活性(圖3)。

2.5 TF改善了PRRSV疫苗免疫豬PBLC的增殖活性

用PRRSV弱毒疫苗-TF免疫仔豬后20 d，通過MTT法檢測PBLC的增殖活性。同時在不同部位注射PRRSV弱毒疫苗和TF組(A組)及接種PRRSV弱毒疫苗與PRRSV-TF混合液組(B組)的PBLC刺激指數(shù)分別為2.83±0.32和2.95±0.38，均顯著高于單獨接種PRRSV弱毒疫苗組(C組)的SI(1.29±0.31)(P<0.01)，但A組和B組間沒有顯著差異(圖4)。結(jié)果表明，TF與PRRSV弱毒疫苗同時分別接種，或者TF與PRRSV弱毒疫苗混合注射，均能夠顯著改善豬的細胞免疫功能。

表1TF中氨基酸的種類及其含量

Table1KindsandcontentsofaminoacidsintheTF

氨基酸類別Kinds of amino acids含量/(mg·mL-1)Contents 天冬氨酸 Asp0.246谷氨酸 Glu0.642組氨酸 His0.065絲氨酸 Ser0.251精氨酸 Arg0.194甘氨酸 Gly0.274蘇氨酸 Thr0.144脯氨酸 Pro0.253丙氨酸 Ala0.195纈氨酸 Val0.152甲硫氨酸 Met0.061半胱氨酸 Cys0.070異亮氨酸 Ile0.129亮氨酸 Leu0.212苯丙氨酸 Phe0.119賴氨酸 Lys0.086酪氨酸 Tyr0.087?；撬?Tau0.298

**. P<0. 01，兩組間差異極顯著**. P<0. 01, mean significant differences between two groups圖2 小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性Fig.2 Phagocytic activity of mice celiac macrophagocytes

*. P<0.05，兩組間差異顯著*. P<0.05, mean significant differences between two groups圖3 小鼠外周血淋巴細胞增殖活性Fig.3 Proliferation activities of mice PBLC

A. PRRSV疫苗與TF分開注射；B. PRRSV疫苗與TF混合液注射；C. PRRSV疫苗單獨免疫。**. P<0. 01，兩組間差異極顯著A. Injecting PRRSV vaccine and TF separately; B. Injecting the mixture of PRRSV vaccine and TF; C. Injecting PRRSV vaccine only. **. P<0. 01, mean significant differences between two groups圖4 免疫豬外周血淋巴細胞的增殖活性Fig.4 Proliferation activities of PBLC from immunized pigs

3 討 論

PRRSV不僅可以引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬死亡，而且還可導致豬非特異性和特異性免疫功能抑制，致使PRRSV感染豬與其他病原混合感染及免疫失敗現(xiàn)象屢屢發(fā)生[21-23]。因此，研究和開發(fā)改善豬免疫功能和提高疫苗免疫效果的免疫增強制劑具有重要意義。轉(zhuǎn)移因子因具備傳遞免疫信息、調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能等優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛用于腫瘤、傳染病、寄生蟲病、過敏和自身免疫性疾病的防治研究與實踐中[16,19,24-25]。用某種抗原免疫人或動物制備的TF對相應疾病的治療效果更好[19,26]，目前臨床上用于治療乙型肝炎病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、艾滋病病毒和寄生蟲等疫病及腫瘤的轉(zhuǎn)移因子多是從用特異抗原免疫機體提取的TF[16]。本研究從PRRSV弱毒活疫苗強化免疫豬的脾內(nèi)提取了TF，該TF由核酸和至少18種氨基酸組成，比孔慶波等[27]從豬脾提取的TF多了一種?；撬幔f明從不同免疫原免疫動物組織提取的轉(zhuǎn)移因子的組成成分可能不完全一致。值得注意的是，?；撬釣榉堑鞍装被幔粎⑴c蛋白的生物合成，但與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)，具有維持正常生殖功能，提高機體免疫力等生物學功能。而且本研究中制備的TF中?；撬岬暮績H次于含量最高的谷氨酸，推測其很可能在調(diào)節(jié)PRRSV感染機體免疫功能與改善免疫效果方面發(fā)揮著較重要的作用。

巨噬細胞和樹突狀細胞等單核/巨噬細胞系是PRRSV的靶細胞。PRRSV能夠在豬肺泡巨噬細胞內(nèi)復制，抑制細胞的吞噬功能以及Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和IFN-γ的表達，同時PRRSV感染引起淋巴細胞總數(shù)降低、CD4+與CD8+T細胞總數(shù)的比值下降，致使機體免疫功能抑制或紊亂，不能及時清除體內(nèi)病毒[2,4,22,28-29]。本試驗發(fā)現(xiàn)從PRRS弱毒活疫苗免疫豬的脾中提取的TF能夠顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，說明其可以改善巨噬細胞的免疫功能。該TF是否會影響宿主Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和IFN-γ的表達以及CD4+與CD8+T細胞總數(shù)的比值，將進一步通過動物試驗加以驗證。

PRRSV感染豬4～6周后，才可以檢測到高親和力的特異性中和抗體IgG，而此前病毒誘導產(chǎn)生的抗體不能中和體內(nèi)病毒，并且還發(fā)現(xiàn)即使在中和抗體存在的條件下，PRRS病毒血癥可以持續(xù)存在[30-32]。這些現(xiàn)象提示在機體抗PRRSV感染免疫中，細胞免疫可能發(fā)揮著重要作用。因此，提高細胞免疫功能對于控制病毒感染具有重要作用。本研究中，TF能夠同時顯著增強小鼠和PRRSV弱毒疫苗免疫豬外周血淋巴細胞的增殖活性，但對免疫豬的特異抗體水平?jīng)]有明顯提高作用(數(shù)據(jù)未在本文顯示)，表明制備的TF主要改善細胞免疫功能，與文獻報道的轉(zhuǎn)移因子主要表現(xiàn)細胞免疫調(diào)節(jié)活性相同[16,24,26]。從PRRSV弱毒活疫苗免疫豬脾中提取的TF具有提高細胞免疫功能的調(diào)節(jié)活性，可能有助于機體對PRRSV的清除，縮短病毒血癥的持續(xù)時間。同時提示該TF與疫苗的聯(lián)合應用對阻止或降低免疫機體被野毒感染具有重要意義。

4 結(jié) 論

從豬繁殖與呼吸綜合征弱毒活疫苗免疫豬的脾中提取了轉(zhuǎn)移因子，其含有核酸和18種氨基酸，不含蛋白質(zhì)。該轉(zhuǎn)移因子能顯著提高小鼠巨噬細胞的吞噬功能和小鼠外周血淋巴細胞的增殖能力，改善PRRSV疫苗免疫豬的細胞免疫功能。