PCBP2促進(jìn)口蹄疫病毒增殖的機制研究

何艷春，楊文萍，付紹祖，鄭海學(xué)*，楊孝樸*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原微生物學(xué) 口蹄疫流行病學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046)

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是一種單股正鏈RNA病毒，能引起牛、豬等多種偶蹄動物發(fā)生口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)[1]。臨床主要表現(xiàn)為患病動物的口、唇和蹄等部位出現(xiàn)水泡或爛斑。發(fā)病率達(dá)100%，死亡率低(可引起幼畜較高的死亡率)，但可造成動物生產(chǎn)能力下降，肉質(zhì)受損，且嚴(yán)重影響種用價值。FMDV基因組包含5′非編碼區(qū)(UTR)、一個完整的開放閱讀框(ORF)和一個帶有Poly(A)尾巴的3′UTR。ORF編碼一個多聚蛋白，隨后被切割成至少13個蛋白，例如VP1、VP2、VP3、VP4、先導(dǎo)蛋白酶(Lpro)、2A、2B、3A、3B1、3B2、3B3、3Cpro和3Dpro[2-3]。病毒衣殼是由VP1、VP2、VP3和VP4四個結(jié)構(gòu)蛋白各60個分子構(gòu)成，其中VP1、VP2和VP3作為病毒衣殼的亞單位，主要構(gòu)成病毒衣殼的外表面。VP4與RNA緊密連接，與FMDV衣殼的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，VP0是VP2和VP4的前體蛋白，其結(jié)構(gòu)中，VP4位于VP2氨基末端的延伸部位。前期研究表明FMDV蛋白可以調(diào)控干擾素的產(chǎn)生，例如，Lpro能抑制poly(I:C)誘導(dǎo)IFN-λ1的啟動子活性；3Cpro通過影響IRF-3/7的活性來拮抗IFN-α1/β的啟動子激活[4]。VP1與宿主蛋白可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白(soluble resistance-related calcium-binding protein, Sorcin)發(fā)生互作抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[5]。VP3通過降解VISA抑制IFN-β的活性[4]。那么是否有宿主蛋白與FMDV蛋白互作通過天然免疫途徑調(diào)控FMDV增殖？本研究發(fā)現(xiàn)宿主蛋白PCBP2能與FMDV VP0互作，并通過天然免疫途經(jīng)調(diào)節(jié)FMDV增殖。

天然免疫在保護(hù)宿主不被病原體入侵中起到關(guān)鍵性作用。Ⅰ型干擾素中IFN-α和IFN-β是先天抗病毒應(yīng)答的核心成員。主要有兩類模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(pathogens-associated molecular patterns, PAMPs)，分別為Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ like receptors, RLRs)[6-8]。RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated protein, MDA5)作為胞質(zhì)傳感器，能檢測到細(xì)胞質(zhì)中RNA病毒(例如仙臺病毒SeV和新城疫病毒NDV等)[9]。在RLRs介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答過程中，入侵細(xì)胞內(nèi)的病毒分子主要被RIG-Ⅰ和MDA5識別，并招募下游位于線粒體的接頭蛋白VISA(也稱作IPS-1、CARDIF和MAVS)[10]來激活下游通路[11]。隨后，VISA通過激活蛋白激酶TBK1磷酸化修飾轉(zhuǎn)錄因子IRF3，使其形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核中[12-13]?；罨霓D(zhuǎn)錄因子IRF3入核后結(jié)合到IFNB1基因啟動子的干擾素刺激反應(yīng)元件ISRE位點，誘導(dǎo)IFNs和多種ISGs因子的產(chǎn)生，并在其他效應(yīng)因子的協(xié)同下發(fā)揮抗病毒功能。

多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2[poly(rC) binding protein 2, PCBP2]是一種在人類和小鼠中廣泛表達(dá)的宿主蛋白，不僅參與RNA的復(fù)制和翻譯[14]，也參與到蛋白之間的相互作用[15-17]。有研究報道PCBP2能與VISA特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)胞中RIG-Ⅰ通路的抗病毒感染應(yīng)答；過表達(dá)PCBP2可特異性引起VISA蛋白的降解從而抑制IFN-β的產(chǎn)生[18]。盡管PCBP2通過特異性降解VISA來抑制RIG-Ⅰ通路的抗病毒免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞中IFN-β啟動子活性，進(jìn)而增強病毒在細(xì)胞中的活性[18]，但是PCBP2與FMDV蛋白通過天然免疫來調(diào)控FMDV增殖的機制還不清楚。作者利用免疫共沉淀試驗、GST pull-down試驗、雙熒光素酶報告系統(tǒng)試驗和Western blot試驗對此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1/myc-HisA載體由本實驗室保存。pcDNA3.1-myc-PCBP2質(zhì)粒、HA-PCBP2質(zhì)粒和帶Flag標(biāo)簽的且被克隆在PCAGGS載體上的各口蹄疫蛋白質(zhì)粒，均由本實驗室構(gòu)建保存，且測序鑒定為正確。雙熒光素酶報告系統(tǒng)所需質(zhì)粒，仙臺病毒(Sendai virus, SeV)以及帶HA標(biāo)簽的VISA質(zhì)粒由武漢大學(xué)舒紅兵院士饋贈。鼠抗Flag、HA、Myc單克隆抗體購于Sigma公司。兔抗VISA多克隆抗體購自BETHYL公司。兔抗GST多克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體購自Thermo公司。HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗和抗兔IgG二抗均購自Santa Cruz公司。人源胚胎腎細(xì)胞系HEK293T用含10%滅活胎牛血清(FBS, Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)在37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2 免疫共沉淀和蛋白印跡

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)皿中，待生長為90%左右的單層細(xì)胞時，將FMDV VP0、VP2、L、2B、2C、3A、3C和3D分別與PCBP2質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。24 h后棄掉培養(yǎng)基，加入NP-40裂解液[50 mmol·L-1Tris (pH 8.0), 150 mmol·L-1NaCl, 5 mmol·L-1EDTA, 1%NP-40, 2 mg·mL-1aprotinin, 2 mg·mL-1leupeptin, 1 mmol·L-1phenylmethanesulfonyl fluoride]，冰上孵育30 min并收集液體，12 000 r·min-1離心10 min。取適量上清加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min后離心，進(jìn)行Western blot試驗；將剩余上清平分，加入IgG抗體和Flag或HA抗體，再加入G蛋白瓊脂糖珠(Sigma)，用裂解液補至1 mL，4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育3 h。用裂解液清洗樹脂3次，SDS-PAGE裂解煮沸，進(jìn)行Western blot。

Western blot試驗方法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入培養(yǎng)好的細(xì)胞，24 h后收樣并處理，煮沸10 min后12 000 r·min-1離心10 min。將處理好的樣品加入蛋白膠孔，跑至底部，用浸泡過甲醇的PVDF膜轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜用5%的脫脂奶粉封閉30 min，之后加入一抗4 ℃搖床過夜，回收抗體，洗三次，加入二抗，洗三次，隨后曝光。

1.3 雙熒光素酶報告試驗

將HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，待細(xì)胞生長至70%左右，將IFN-β-Luc/ISRE-Luc報告質(zhì)粒、PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒以及PCBP2三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞，用空載體確保每一個孔接收相同的質(zhì)粒。24 h 后用SeV(100 HAU·mL-1)進(jìn)行接毒試驗，12 h后處理細(xì)胞，用雙熒光素酶報告基因試劑盒(Promega)照其說明書進(jìn)行試驗。

1.4 GST pull-down試驗

首先取80 μL GST樹脂于EP管中，10% BSA封閉，于4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育4～6 h。然后加入TIF buffer(1.0 mmol·L-1MgCl2, 20 mmol·L-1Tris (pH 8.0), 0.1% Nonidet P-40, 150 mmol·L-1NaCl, 10% glycerol, 0.1 mmol·L-1DTT)清洗樹脂六次。在封閉好的樹脂中分別加入純化的GST和GST融合蛋白，用TIF buffer補液，于4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育2.5 h后清洗樹脂，然后在樹脂中加入表達(dá)有目的質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞裂解液，于4 ℃ 旋轉(zhuǎn)搖床孵育4～6 h，清洗樹脂，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸處理，進(jìn)行Western blot試驗。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(數(shù)據(jù)為三次獨立試驗的平均值)。差異顯著性用“*”表示(*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001)

2 結(jié) 果

2.1 鑒定與PCBP2發(fā)生互作的FMDV蛋白

為了驗證PCBP2與哪些口蹄疫病毒蛋白有相互作用，將FMDV VP0、VP2、L、2B、2C、3A、3C和3D分別與PCBP2表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，免疫共沉淀試驗顯示PCBP2與FMDV的VP2、2B、L、VP0、2C和3D有相互作用(圖1a、b)。進(jìn)一步用GST pull-down試驗證實PCBP2與FMDV的VP0、VP2、2B、2C和3D有相互作用(圖1c、d)。

2.2 PCBP2負(fù)調(diào)控VISA介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路

為了探究豬源PCBP2是否對Ⅰ型干擾素通路有影響，首先將HEK293T細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞板，每組樣品設(shè)置4個重復(fù)，16 h后將重組質(zhì)粒Myc-PCBP2、100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc報告質(zhì)粒、20 ng PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，用相應(yīng)空載體確保每一個孔細(xì)胞接收相同質(zhì)粒，24 h后用SeV刺激4個重復(fù)中的2個重復(fù)，剩下2個重復(fù)不做接毒處理，12 h后收集樣品進(jìn)行雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測。結(jié)果表明，豬源PCBP2抑制IFN-β和ISRE的活性(圖2a、b)。

進(jìn)一步將不同劑量Myc-PCBP2(0、0.3、0.6、1.2 μg)與100 ngIFN-β-Luc/ISRE-Luc報告質(zhì)粒、20 ng PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后進(jìn)行雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測。結(jié)果表明，豬源PCBP2抑制VISA誘導(dǎo)的IFN-β和ISRE的活性(圖2c、d)。

2.3 FMDV蛋白2C、3D、VP0、2B增加了豬源PCBP2對IFN-β啟動子活性的抑制作用

為了探索哪些FMDV蛋白影響PCBP2負(fù)調(diào)控VISA介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路。將FMDV蛋白L、VP2、2C、3D、VP0、2B(均100 ng)分別與Myc-PCBP2(500 ng)、100 ng IFN-β-Luc報告質(zhì)粒、20 ng PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒以及2.5 ng HA-VISA質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，雙熒光素酶報告系統(tǒng)試驗證明，2C、3D、VP0、2B蛋白促進(jìn)PCBP2對IFN-β的抑制作用(圖3)。

a、b. 將帶Flag標(biāo)簽的FMDV蛋白VP2、2B、3A、L、VP0、2C、3C和3D(10 μg)分別與HA-PCBP2(10 μg)共同轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞(2×106)，用HA/IgG(a)和Flag/IgG(b)抗體進(jìn)行免疫共沉淀，隨后用Flag/HA進(jìn)行蛋白印跡試驗；c、d.將帶有Flag標(biāo)簽的口蹄疫病毒蛋白L、VP0、VP2、2B、2C、3D(10 μg)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后進(jìn)行GST pull-down試驗，圖上從左到右依次為2B分別與GST、GST-PCBP2，2C分別與GST、GST-PCBP2，3D分別與GST、GST-PCBP2，L分別與GST、GST-PCBP2，VP0分別與GST、GST-PCBP2以及VP2分別與GST、GST-PCBP2的GST pull-down試驗，隨后用Flag(上)、GST(中)進(jìn)行蛋白印跡試驗，WCL(底部)是用蛋白印跡試驗驗證蛋白表達(dá)a, b. HEK293T cells (2×106) were transfected with the indicated plasmids (10 μg each). Immunoprecipitation, with anti-Flag (HA) or control mouse immunoglobulin (IgG) of proteins from lysates and immunoblot were performed with anti-HA or anti-Flag; c, d. Flag-tagged FMDV proteins L, VP0, VP2, 2B, 2C, 3D transfected for 24 h with 10 μg plasmid, tested by GST pull-down. GST pull-down (from left to right): 2B/GST, 2B/GST-PCBP2, 2C/GST, 2C/GST-PCBP2, 3D/GST, 3D/GST-PCBP2, L/GST, L/GST-PCBP2, VP0/GST, VP0/GST-PCBP2, VP2/GST, VP2/GST-PCBP2 and immunoblot were performed with anti-Flag (top) or anti-GST (middle), WCL (bottom), expression of proteins圖1 與PCBP2發(fā)生互作的FMDV蛋白Fig.1 The FMDV proteins interact with PCBP2

a、b.將重組質(zhì)粒Myc-PCBP2(0、500 ng)、100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc報告質(zhì)粒、20 ng PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后用SeV刺激12 h(右)，收集樣品進(jìn)行雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測；c、d. 將不同劑量Myc-PCBP2(0、0.3、0.6、1.2 μg)與100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc報告質(zhì)粒、20 ng PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后進(jìn)行雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測；EV、VEC指相對應(yīng)載體蛋白的空載體；每組數(shù)據(jù)均為三次或者三次以上獨立試驗的結(jié)果；**.P<0.01為差異極顯著a, b. HEK293T cell were transfected with 100 ng reporter plasmid (IFN-β-Luc/ISRE-Luc), 20 ng pRL-TK and PCBP2 (0, 500 ng) and infected for 24 h with SeV (right), assessed as luciferase activity after 12 h; c, d. HEK293T cell were transfected with luciferase reporter constructs plus PCBP2 (0, 0.3, 0.6, 1.2 μg), assessed as luciferase activity after 24 h. EV. Empty vector; VEC. Vector empty control; The results represent the means and standard deviations of data from three independent experiments. **.P<0.01圖2 豬源PCBP2抑制VISA誘導(dǎo)的IFN-β和ISRE的產(chǎn)生Fig.2 Porcine PCBP2 inhibites VISA-induced IFN-β and ISRE

a、b、c、d、e、f. 將FMDV蛋白L、VP2、2C、3D、VP0、2B(0、100、0、100 ng)分別與Myc-PCBP2(0、0、500、500 ng)、100 ng IFN-β-Luc報告質(zhì)粒、20 ng PRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后進(jìn)行雙熒光素酶報告系統(tǒng)試驗。EV指相對應(yīng)載體蛋白的空載體；Con. VP0載體蛋白相對應(yīng)的空載體是PCAGGS，Myc-PCBP2對應(yīng)的空載體是pcDNA3.1；每組數(shù)據(jù)均為三次或者三次以上獨立試驗的結(jié)果；**.P<0.01為差異極顯著a, b, c, d, e, f. HEK293T cell were transfected with 100 ng reporter plasmid, 20 ng pRL-TK, HA-VISA (0, 2.5 ng) various FMDV plasmids (0, 100, 0, 100 ng) and Myc-PCBP2 (0, 0, 500, 500 ng) for 24 h, assessed as luciferase activity. EV. Empty vector; Con.The corresponding empty vector of VP0 is PCAGGS, the corresponding empty vector of Myc-PCBP2 is pcDNA3.1;The results represent the means and standard deviations of data from three independent experiments. **P<0.01圖3 2C、3D、VP0、2B蛋白促進(jìn)PCBP2對IFN-β的抑制作用Fig.3 The effect of IFN-β inhibited by PCBP2 is promoted by 2C, 3D, VP0, 2B proteins

2.4 VP0促進(jìn)PCBP2對VISA的特異性降解

為了驗證哪些FMDV蛋白促進(jìn)PCBP2降解VISA，將FMDV 2C、3D、VP0和2B蛋白(600 ng)分別與豬源PCBP2(1 μg)、VISA(800 ng)共轉(zhuǎn)染，Western blot試驗顯示FMDV VP0和3D促進(jìn)PCBP2特異性降解外源VISA(圖4a～d)。進(jìn)一步試驗表明，只有VP0促進(jìn)PCBP2對內(nèi)源VISA的特異性降解(圖4e、f)。

3 討 論

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、接觸性傳染的動物疫病，是國家乃至全球經(jīng)濟貿(mào)易的最大羈絆。由于FMDV廣泛的宿主范圍，高效的變異頻率[19-20]，從而有利于FMDV逃避宿主免疫監(jiān)視，建立持續(xù)性感染[21]。宿主細(xì)胞作為FMDV生命活動載體，在其生活周期中，發(fā)現(xiàn)有多種宿主細(xì)胞蛋白參與其中。由于FMDV是一種RNA病毒，這些細(xì)胞蛋白里有一部分是RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)，例如多聚嘧啶結(jié)合蛋白(PTB)[22]、La自身抗原(La autoantigen)[23]、核糖體40S亞基(40S ribosomal subunit)[24]、突觸結(jié)合胞質(zhì)RNA相互作用蛋白(NSAP1)[25-26]以及核不均一核糖核蛋白(hnRNP)[27]等，而PCBP2細(xì)胞蛋白是屬于特異性結(jié)合RNA胞嘧啶富集片段的HnRNP[28-30]。已有研究報道PCBP2能夠調(diào)控細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]，促進(jìn)FMDV的增殖[31]，那么闡明PCBP2在FMDV引起免疫抑制中的分子機制，則有利于對FMD進(jìn)行有效的防控提供科學(xué)依據(jù)。本文首先驗證出與PCBP2發(fā)生互作的FMDV蛋白(VP2、2B、VP0、2C、3D)。接著闡明PCBP2負(fù)調(diào)控細(xì)胞的免疫應(yīng)答。將互作蛋白分別與PCBP2共轉(zhuǎn)染，雙熒光素酶報告試驗初步證實2C、3D、VP0和2B進(jìn)一步抑制IFN-β的產(chǎn)生。據(jù)文獻(xiàn)報告，PCBP2能夠通過E3泛素連接酶AIP4泛素化降解VISA，以達(dá)到對細(xì)胞免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控作用[32]，隨后將2C、3D、VP0和2B分別與PCBP2共轉(zhuǎn)染，Western blot試驗檢測內(nèi)、外源VISA的降解情況。結(jié)果表明，VP0和PCBP2共轉(zhuǎn)染能增加VISA的降解，從而減少免疫應(yīng)答中IFN-β的產(chǎn)生，增強FMDV在宿主細(xì)胞中的活性。前言中提到VP3也能降解VISA，抑制IFN-β的產(chǎn)生，但VP3是通過影響VISA的RNA水平達(dá)到降解VISA蛋白的目的，抑制細(xì)胞的免疫應(yīng)答；而VP0對VISA轉(zhuǎn)錄水平的影響將在后續(xù)試驗中進(jìn)行，目前推測VP0可能通過泛素化途徑直接或間接降解VISA，以達(dá)到對IFN-β啟動子活性的抑制，促進(jìn)FMDV的增殖，這些猜想還需要進(jìn)一步驗證。對于VP0、PCBP2和VISA三者之間的具體關(guān)系，也需要我們繼續(xù)深入研究下去。

a、b、c、d. 將FMDV 2C、3D、VP0和2B蛋白(600 ng)分別與豬源Myc-PCBP2(1 μg)、HA-VISA(800 ng)轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，24 h后進(jìn)行Western blot試驗；e、f. 將FMDV VP0和3D蛋白(600 ng)分別與豬源Myc-PCBP2(1 μg)轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，24 h后進(jìn)行Western blot試驗a, b, c, d. Immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding HA-tagged VISA (800 ng)， Myc-tagged PCBP2 (1 μg) and various FMDV plasmids (600 ng) for 24 h; e, f. Immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding Myc-tagged PCBP2 (1 μg) and various FMDV plasmids (600 ng) for 24 h圖4 VP0加速PCBP2對VISA的特異性降解Fig.4 VP0 accelerate the specific degradation of VISA from PCBP2

4 結(jié) 論

PCBP2能夠與FMDV蛋白VP0、VP2、2B、2C和3D發(fā)生相互作用，且負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的信號通路，同時PCBP2能特異性降解VISA并呈劑量依賴效應(yīng)；雙熒光素酶報告試驗證實VP0、2B、2C和3D蛋白可以促進(jìn)PCBP2對IFN-β啟動子活性的抑制作用，其中只有VP0蛋白能協(xié)助PCBP2進(jìn)一步引起VISA的特異性降解。由此可知，PCBP2通過與FMDV VP0蛋白相互作用，引起通路蛋白VISA的進(jìn)一步降解，導(dǎo)致宿主細(xì)胞中IFN-β分泌減少，從而保護(hù)FMDV在細(xì)胞中的繁殖和生長。