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    流行性出血病多克隆抗體C-ELISA檢測(cè)方法的建立

    2018-08-07 11:44:42朱建波楊振興苗海生何于雯孟錦昕李華春
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2018年7期
    關(guān)鍵詞:豚鼠試劑盒陰性

    朱建波,楊振興,肖 雷,高 林,苗海生,何于雯,孟錦昕,楊 恒,李華春

    (云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650224)

    流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease,EHD)是通過(guò)節(jié)肢昆蟲(chóng)庫(kù)蠓傳播流行性出血病病毒(EHDV),引起的一種非接觸傳染病[1]。該病能感染野生及家養(yǎng)反芻動(dòng)物,特別是引起白尾鹿體溫升高、黏膜和漿膜面廣泛出血,并常于昏迷狀態(tài)下死亡[2]。牛感染發(fā)病,癥狀主要是發(fā)熱、厭食、潰瘍性口炎、呼吸疾病、一些組織器官特別是舌的出血壞死,茨城病由EHDV-2病毒型感染引起,可致牛消瘦、脫水,最后因肺炎而死[3]。部分羊也能感染發(fā)病,癥狀主要表現(xiàn)為皮下水腫,心外膜、眼結(jié)膜和瘤胃及腸的漿膜表面出血,胸部和心包囊有黃色液體,鼻排帶綠色黏質(zhì)物[4]。此病在流行期危害較大,嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)和國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已將EHD列為法定報(bào)告?zhèn)魅静5]。

    近年來(lái),云南、新疆、內(nèi)蒙古、廣西和廣東等地進(jìn)行的血清學(xué)調(diào)查均檢出EHDV陽(yáng)性血清,特別是存在對(duì)牛有較強(qiáng)致病力的EHDV-2、6和7型[6-9]。2015年曹穎穎等[10]在廣西分離到EHDV-5型毒株,2016年呂敏娜等[11]在廣東分離到EHDV-1型毒株,本實(shí)驗(yàn)室自2012年至2017年間在云南牛體內(nèi)分離到多株EHDV-1、2、5、6和7型毒株。以上結(jié)果表明EHDV在我國(guó)分布廣泛,存在發(fā)生該病的風(fēng)險(xiǎn),因此該病的血清學(xué)檢測(cè)方法研究對(duì)我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易及疫病防控具有重要意義。

    目前,有學(xué)者用表達(dá)的EHDV VP7蛋白作包被抗原建立檢測(cè)抗體的間接ELISA方法,或用EHDV群特異性單克隆抗體建立了C-ELISA檢測(cè)方法,但均無(wú)商品化試劑盒[12-14]。本實(shí)驗(yàn)室曾制備多株EHDV單克隆抗體,由于均未達(dá)到診斷檢測(cè)要求,無(wú)法用于組裝高質(zhì)量C-ELISA試劑盒。所以本研究選擇用純化滅活后的EHDV-6型病毒作為ELISA檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)抗原,豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)抗體與待檢抗體競(jìng)爭(zhēng),通過(guò)抑制率大小來(lái)判斷待檢血清陰陽(yáng)性,建立了檢測(cè)EHDV抗體的C-ELISA方法。該方法具有較好的特異性和敏感度,同時(shí)具有快速診斷、使用方便等優(yōu)點(diǎn),為EHDV血清抗體普查提供了一種有效工具。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    高吸附ELISA板購(gòu)自COSTAR公司,抗原保護(hù)劑購(gòu)自CANDOR公司,羊抗豚鼠HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自Abcam公司,TMB購(gòu)自SurModics公司,脫脂奶粉購(gòu)自BD difco公司,BCA Protein Assay Kit購(gòu)自TaKaRa公司,二乙烯亞胺(BEI)、佐劑206由云南省保山疫苗廠提供,0.01 mol·L-1PBS中加入0.05%的Tween-20配制成PBST洗液,PBST中加入1%的脫脂奶粉配制成稀釋液。

    1.2 毒株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、血清及細(xì)胞

    EHDV-2、6型毒株由本實(shí)驗(yàn)室從2012年云南師宗牛血中分離獲得,經(jīng)病毒中和試驗(yàn)和基因序列分析鑒定定型。5月齡豚鼠購(gòu)自云南省昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心,健康無(wú)疾病,檢驗(yàn)合格;黃牛和山羊購(gòu)自云南牲畜交易市場(chǎng),6月齡,健康無(wú)病,經(jīng)核酸RT-PCR及血清中和試驗(yàn)檢測(cè),證明未感染過(guò)EHDV。不同血清型EHDV陽(yáng)性血清及陰性血清,藍(lán)舌病病毒(BTV)、山羊痘病毒(GPV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)陽(yáng)性血清,由本實(shí)驗(yàn)室保存;小反芻獸疫病毒(PPRV)陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng);口蹄疫病毒(FMDV)、牛流行熱病毒(BEFV)陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng);BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.3 病毒純化及抗血清制備

    采用長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)EHDV-2、6型毒株,7 d出現(xiàn)100%細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)后收獲病毒,冰水浴下超聲波破碎處理3次,將上層液體置于30%~70%的蔗糖連續(xù)密度梯度上進(jìn)行密度梯度離心,8 ℃ 35 000 r·min-1離心4 h,在40%~60%結(jié)合處獲得純化的病毒帶,37 ℃ 1.5 mmol·L-1BEI滅活處理12 h,6型病毒作為包被抗原,2型病毒經(jīng)佐劑206乳化,按每只免疫0.5 mL,免疫4只豚鼠,21 d后加強(qiáng)免疫1次,每次免疫7 d后采血分離血清,進(jìn)行血清中和試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)。

    1.4 最佳抗原包被濃度和競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度的確定

    用棋盤(pán)法篩選最佳抗原包被濃度和最佳競(jìng)爭(zhēng)抗體使用濃度。將純化滅活后的6型EHDV抗原用包被液按1∶4 000~1∶14 000倍稀釋?zhuān)?0 μL·孔-14 ℃ 過(guò)夜包被反應(yīng)板;PBST洗滌后用5%的馬血清37 ℃封閉 2 h;拍干馬血清,每孔各加入10 μL的陰性(N)和陽(yáng)性(P)血清后,加入用稀釋液按同樣稀釋倍數(shù)配制好的豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗體(競(jìng)爭(zhēng)抗體)50 μL·孔-137 ℃ 30 min;拍干液體后加入HRP酶標(biāo)抗體50 μL·孔-137 ℃ 30 min;PBST洗板6次,加入TMB 50 μL·孔-1,避光顯色12 min;每孔加入50 μL 1.5 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng),測(cè)定OD450 nm值,比較陰陽(yáng)性對(duì)照OD450 nm值(N/P值),N/P值最大的反應(yīng)孔中使用的包被濃度和競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度即為最佳濃度。

    1.5 臨界值的確定

    對(duì)270份(180份牛血清和90份羊血清)陰性血清進(jìn)行C-ELISA檢測(cè),對(duì)所有的抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算樣本的平均抑制率和標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)。根據(jù)公式:臨界值=陰性樣品平均抑制率+3×s[15],計(jì)算出臨界值。對(duì)270份(250份牛血清和20份羊血清)陽(yáng)性血清進(jìn)行C-ELISA檢測(cè),確定最小陽(yáng)性血清抑制率(present inhabitation,PI),PI=(陰性對(duì)照OD-樣品OD)/陰性對(duì)照OD[16]。綜合陰性和陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果,確定試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)。

    1.6 特異性試驗(yàn)

    對(duì)各1份EHDV(1、2、5、6、7和8型)和BTV(1~24 型)陽(yáng)性血清,各2份GPV、AKAV、CHUV、PPRV、FMDV、BEFV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),確定檢測(cè)方法的特異性。

    1.7 敏感性試驗(yàn)

    將已知血清中和抗體效價(jià)的各1份EHDV(1、2、5、6、7和8型)陽(yáng)性血清從1∶10倍開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑫r(shí)進(jìn)行血清中和試驗(yàn)(SNT)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)和C-ELISA檢測(cè),比較三種方法檢出陽(yáng)性的血清最大稀釋度,驗(yàn)證試劑盒的敏感性。

    1.8 臨床樣品測(cè)定試驗(yàn)

    2014—2017年間,每年挑選10頭牛和5頭山羊作為監(jiān)控動(dòng)物,經(jīng)核酸及SNT檢測(cè),證明未感染過(guò)EHDV,放養(yǎng)在云南師宗農(nóng)戶(hù)家中組成監(jiān)控群。每年4月至11月每周采集一次血清和抗凝血,11月 至次年3月每月采集一次,次年4月更換監(jiān)控動(dòng)物,分別用C-ELISA、SNT檢測(cè)血清,RT-PCR和病毒分離試驗(yàn)檢測(cè)抗凝血,比較這4種方法的符合情況。

    1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

    從同一批次(WH603-1W)及不同批次(WH603-2W、WH603-3W、WH603-4W和WH603-5W)C-ELISA 試劑盒中隨機(jī)取4個(gè),分別檢測(cè)4份陽(yáng)性樣品和4份陰性樣品,并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,每份樣本重復(fù)2孔,計(jì)算PI值的變異系數(shù),以檢驗(yàn)批次內(nèi)及批次間重復(fù)性。

    1.10 再現(xiàn)性試驗(yàn)

    將各4份的陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性血清分成3管,各取2管同2個(gè)試劑盒、結(jié)果統(tǒng)計(jì)表和操作說(shuō)明,分別采用冷鏈運(yùn)輸(環(huán)境溫度控制在4~8 ℃)送至新疆畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所(Lab 1)、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Lab 2),2 d內(nèi)到達(dá)。剩下1管 血清留在本實(shí)驗(yàn)室,即云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(Lab 3)進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室收到樣品,2 d內(nèi)開(kāi)始檢測(cè),設(shè)置三個(gè)重復(fù)。完成后將檢測(cè)結(jié)果報(bào)至本實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行再現(xiàn)性分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 病毒純化及抗體制備

    用PBS將純化滅活后的2型EHDV稀釋250倍,BAC法測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度為192 μg·mL-1,佐劑乳化后免疫豚鼠,每次免疫后取血測(cè)定血清中和抗體效價(jià)(表1),1號(hào)和3號(hào)豚鼠在試驗(yàn)過(guò)程中死亡,2號(hào)和4號(hào)豚鼠3次免疫后血清中和抗體效價(jià)為1∶2 560和1∶1 810,選取2號(hào)豚鼠高免血清作為競(jìng)爭(zhēng)抗體使用。

    2.2 最佳抗原包被濃度和最佳競(jìng)爭(zhēng)抗體濃度的確定

    棋盤(pán)法滴定結(jié)果顯示6型EHDV抗原按1∶10 000 倍稀釋(總蛋白質(zhì)量濃度為5.12 μg·mL-1),競(jìng)爭(zhēng)抗體按1∶10 000倍稀釋時(shí),陰性對(duì)照(N)OD450 nm為1.04,接近1.0;陽(yáng)性對(duì)照(P)OD450 nm為0.074,背景較低;陰陽(yáng)反差N/P值14.05,最大,因此在C-ELISA體系中抗原1∶10 000稀釋包被反應(yīng)板,競(jìng)爭(zhēng)抗體最佳工作濃度為稀釋1∶10 000倍(表2)。

    2.3 臨界值的確定

    對(duì)270份牛、羊陰性血清進(jìn)行C-ELISA檢測(cè),平均PI值為4.88%,標(biāo)準(zhǔn)差(s)為0.133,根據(jù)公式:臨界值=陰性樣品平均抑制率+3×s,計(jì)算出臨界值為44.78%;對(duì)同樣數(shù)量的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè) 并計(jì)算PI值,最小PI為45.87%,平均PI為76.00%,對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖1)。PI在40%~50%間為在一個(gè)過(guò)渡區(qū)域,極少數(shù)陰性和弱陽(yáng)性血清樣品存在此期間內(nèi),為保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性,將臨界值設(shè)定為50%,PI>50%判定為陽(yáng)性,PI在40%~50%之間判定為可疑。

    表1豚鼠血清中和抗體效價(jià)

    Table1Neutralizingantibodytiterofguineapigserum

    動(dòng)物編號(hào)Animals No.抗體效價(jià) Antibody titer0次免疫Non immune1次免疫Primary immune2次免疫Secondary immune3次免疫Tertiary immune101∶1131∶453死亡Die201∶571∶6401∶2 560301∶80死亡Die-401∶1601∶1 2801∶1 810

    表2包被抗原及競(jìng)爭(zhēng)抗體最佳濃度的確定

    Table2DeterminationofoptimalconditionsofthecompetitiveELISA

    包被抗原稀釋度Antigen dilution指標(biāo)Indexes豚鼠抗EHDV抗體稀釋度Guinea pig anti-EHDV antibody dilution1∶4 0001∶6 0001∶8 0001∶10 0001∶12 0001∶14 0001∶4 000OD450 nmN1.831.701.541.431.251.18OD450 nmP0.1890.1750.1640.1510.1370.108N/P9.689.719.399.479.1210.93 1∶6 000OD450 nmN1.721.591.481.291.201.11OD450 nmP0.1790.170.1580.1420.1170.091N/P9.619.359.379.0810.2612.20 1∶8 000OD450 nmN1.561.431.241.161.010.82OD450 nmP0.1680.1520.1380.1140.0830.077N/P9.299.418.9910.1812.1710.65 1∶10 000OD450 nmN1.431.241.121.040.890.76OD450 nmP0.1520.1310.1030.0740.0690.068N/P9.419.4710.8714.0512.9011.18 1∶12 000OD450 nmN1.261.111.020.870.780.69OD450 nmP0.1390.1160.0880.0710.0680.065N/P9.069.5711.5912.2511.4710.62 1∶14 000OD450 nmN1.151.030.890.750.690.48OD450 nmP0.1130.0940.0760.0690.0650.064N/P10.1810.9611.7110.8710.627.50

    2.4 特異性試驗(yàn)

    對(duì)各1份的不同血清型EHDV和BTV陽(yáng)性血清,各2份GPV、AKAV、CHUV、PPRV、FMDV、BEFV陽(yáng)性血清進(jìn)行C-ELISA檢測(cè)(表3)。結(jié)果表明不同血清型EHDV血清檢測(cè)均為陽(yáng)性,24種血清型BTV陽(yáng)性血清及其他相關(guān)病毒陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性。因此,該ELISA方法具有較好的群特異性,與其他牛、羊易感病毒的陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。

    圖1 270份陰性血清和270份陽(yáng)性血清C-ELISA PI值頻率分布圖Fig.1 Distribution of the EHDV C-ELISA results of 270 negative sera and 270 positive sera

    2.5 敏感性試驗(yàn)

    將中和抗體效價(jià)為1∶113、1∶160、1∶320、1∶320、1∶226和1∶453的6種不同血清型EHDV血清,從1∶10開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)瑫r(shí)進(jìn)行C-ELISA、SNT和AGID檢測(cè)(表4)。C-ELISA能檢測(cè)出陽(yáng)性的血清最大稀釋度分別為1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶1 280、1∶640和1∶1 280,均高于SNT和AGID;AGID能檢出陽(yáng)性的血清稀釋度最小,超過(guò)1∶80倍,檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

    表3EHDVC-ELISA特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

    Table3ThespecificityassayofEHDVC-ELISA

    血清Sera抗體效價(jià)Titer抑制率/%PI判定結(jié)果Result血清Sera抗體效價(jià)Titer抑制率/%PI判定結(jié)果ResultEHDV-11∶16086.72+BTV-161∶32013.10-EHDV-21∶16085.60+BTV-171∶1131.70-EHDV-51∶32091.50+BTV-181∶4011.75-EHDV-61∶16087.50+BTV-191∶4010.70-EHDV-71∶32089.90+BTV-201∶579.83-EHDV-81∶32089.40+BTV-211∶8021.40-BTV-11∶2822.50-BTV-221∶1131.33-BTV-21∶576.40-BTV-231∶4012.41-BTV-31∶4021.10-BTV-241∶5713.50-BTV-41∶8015.20-GPV No. 1Positive4.31-BTV-51∶5712.30-GPV No. 2Positive5.20-BTV-61∶1135.80-AKAV No. 11∶403.10-BTV-71∶1600.30-AKAV No. 21∶571.70-BTV-81∶3200.40-CHUV No. 11∶5711.75-BTV-91∶4023.50-CHUV No. 21∶8010.70-BTV-101∶5720.95-PPRV No. 11∶809.83-BTV-111∶22620.70-PPRV No. 21∶5713.10-BTV-121∶11323.00-FMDV No. 11∶641.70-BTV-131∶570.28-FMDV No. 21∶1281.75-BTV-141∶8021.30-BEFV No. 11∶11310.70-BTV-151∶16023.00-BEFV No. 21∶809.83-

    +.陽(yáng)性;-.陰性

    +.Positive;-.Negative

    表4C-ELISA、SNT和AGID檢測(cè)敏感度的比較

    Table4ThecomparisonofsensitiveofC-ELISA,SNTandAGID

    血清型Serotype抗體效價(jià)Titer檢測(cè)方法Methods不同血清稀釋度的檢測(cè)結(jié)果a Detection results of different serum dilution a1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶1 2801∶2 560EHDV-11∶113C-ELISA(PI/%)83.1279.4575.1670.6565.0359.1143.0734.7227.73SNT++++-----AGID+++------EHDV-21∶160C-ELISA(PI/%)88.0185.4580.3277.1274.9268.0357.2143.3234.95SNT+++++----AGID+++------EHDV-51∶320C-ELISA(PI/%)90.8786.8181.0680.6076.5369.0262.8154.0439.73SNT++++++---AGID++++-----EHDV-61∶320C-ELISA(PI/%)91.7088.3083.4080.7075.5066.3061.3053.2636.40SNT++++++---AGID++++-----EHDV-71∶226C-ELISA(PI/%)89.2185.3580.9779.6973.3263.1158.2847.1426.37SNT+++++----AGID+++------EHDV-81∶453C-ELISA(PI/%)91.9688.7084.4481.6079.3475.6765.5954.3530.67SNT++++++---AGID++++-----

    a. 檢測(cè)結(jié)果:C-ELISA以“PI/%”表示;SNT、AGID 以“陰、陽(yáng)性”表示(+.陽(yáng)性;-.陰性)

    a. Detection results: C-ELISA results are displayed withPI(%); SNT, AGID results are displayed with positive or negative (+.Positive;-.Negative)

    2.6 臨床樣品測(cè)定

    2014—2017年間,共對(duì)40頭牛和20頭羊采集的各1 980份血清和抗凝血進(jìn)行C-ELISA、RT-PCR及病毒分離檢測(cè)。C-ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),2014年6、7月3頭牛轉(zhuǎn)陽(yáng),轉(zhuǎn)陽(yáng)率為30%;2015年8月1頭牛轉(zhuǎn)陽(yáng),轉(zhuǎn)陽(yáng)率為10%;2016年10月2頭牛轉(zhuǎn)陽(yáng),轉(zhuǎn)陽(yáng)率為20%;2017年6月2頭牛轉(zhuǎn)陽(yáng),轉(zhuǎn)陽(yáng)率為20%,除2016年動(dòng)物在10月轉(zhuǎn)陽(yáng),其余動(dòng)物均在6—8月轉(zhuǎn)陽(yáng),說(shuō)明夏季蟲(chóng)媒活動(dòng)更頻繁,易引起蟲(chóng)媒病傳播。4年間均未發(fā)現(xiàn)山羊血清轉(zhuǎn)陽(yáng),動(dòng)物血清轉(zhuǎn)陽(yáng)前后幾周試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。測(cè)定分離病毒TICD50后,用病毒同對(duì)應(yīng)牛的血清進(jìn)行SNT,血清轉(zhuǎn)陽(yáng)結(jié)果同C-ELISA結(jié)果吻合;抗凝血RT-PCR檢測(cè)及病毒分離證明血清轉(zhuǎn)陽(yáng)動(dòng)物均被EHDV感染,感染時(shí)間和血清轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間吻合;其他動(dòng)物樣品4種方法連續(xù)檢測(cè)結(jié)果均為陰性,說(shuō)明該方法能準(zhǔn)確檢測(cè)出動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)陽(yáng),有很好的準(zhǔn)確性。

    2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

    從同一批次及不同批次EHDV C-ELISA試劑盒中隨機(jī)抽取4個(gè)試劑盒,分別檢測(cè)8份樣品,批次間變異系數(shù)在2.62%~8.72%,批次內(nèi)變異系數(shù)在2.95%~8.89%,變異系數(shù)均小于10%(表6),表明該試劑盒有較好的批次內(nèi)及批次間重復(fù)性。

    表5臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

    Table5ResultsofclinicalsamplestestedbyC-ELISA,RT-PCRandvirusisolation

    動(dòng)物Animal采血日期Date of blood collection檢測(cè)結(jié)果a Detection resultsaC-ELISA(PI/%)SNTRT-PCR病毒分離Virus isolation牛-82014-06-2413.95---No. 82014-07-0110.50---2014-07-0812.38-+-2014-07-1561.281∶5++2014-07-2280.251∶28+-2014-07-2983.171∶54--2014-08-0587.651∶80--2014-08-1288.341∶113--2014-08-1888.031∶80--牛-102014-06-1010.33---No. 102014-06-1738.22-+-2014-06-2453.10-++2014-07-0172.691∶20+-2014-07-0877.981∶28+-2014-07-1572.621∶40--2014-07-2282.281∶54--2014-07-2982.401∶80--2014-08-0583.671∶80--牛-212014-07-0810.19---No. 212014-07-1520.37---2014-07-2226.43-+-2014-07-2972.601∶7++2014-08-0582.341∶40+-2014-08-1280.571∶54--2014-08-1883.521∶80--2014-08-2583.511∶113--2014-09-0288.371∶113--牛-72015-07-2818.87---No. 72015-08-0412.55---2015-08-1144.72-++2015-08-1855.67-++2015-08-2570.261∶20+-2015-09-0182.181∶54+-2015-09-0887.031∶113--2015-09-1586.591∶160--2015-09-2888.871∶113--

    (轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

    a. 檢測(cè)結(jié)果:C-ELISA以“PI/%”表示;SNT以“陰性(-)”或具體數(shù)值表示;RT-PCR、病毒分離試驗(yàn)以“陰、陽(yáng)性”表示(+.陽(yáng)性;-.陰性)

    a. Detection results: C-ELISA results are displayed withPI(%); SNT, AGID results are displayed with negative (-) or detailed values; RT-PCR, virus isolation results are displayed with positive or negative (+.Positive;-.Negative)

    表6C-ELISA重復(fù)性試驗(yàn)(n=8)

    Table6RepeatabilityassayforC-ELISA(n=8)

    樣品序號(hào)Sample No.批次內(nèi)Intra batch批次間Inter batch 結(jié)果(x±s)Result變異系數(shù)/%CV結(jié)果(x±s)Result變異系數(shù)/%CV Positive 10.763±0.0202.620.745±0.0222.95Positive 20.845±0.0252.960.857±0.0303.50Positive 30.848±0.0283.300.862±0.0354.06Positive 40.797±0.0243.010.773±0.0314.01Negative 10.210±0.0167.410.214±0.0188.41Negative 20.056±0.0047.620.059±0.0058.47Negative 30.195±0.0178.720.180±0.0168.89Negative 40.130±0.0096.920.133±0.0118.27

    2.8 再現(xiàn)性試驗(yàn)

    在3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室,用該試劑盒檢測(cè)同樣的4份陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性血清。結(jié)果表明12份血清樣品在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果相一致,陰陽(yáng)性判斷完全正確,變異系數(shù)在1.14%~8.44%之間,均小于10%(表7),說(shuō)明該試劑盒再現(xiàn)性較好。

    表7再現(xiàn)性試驗(yàn)

    Table7Reproducibilitytestindifferentlaboratories

    樣品Sample No.不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果Results of different laboratoryLab 1Lab 2Lab 3x±s變異系數(shù)/%CVPositive 10.8210.7800.8400.814±0.0313.81Positive 20.8190.8110.8570.829±0.0242.95Positive 30.8820.8710.8910.881±0.0101.14Positive 40.8580.8400.8620.853±0.0121.37Weak Positive 10.5070.5240.5320.521±0.0132.41Weak Positive 20.5610.5530.5860.567±0.0183.12Weak Positive 30.5520.5420.5690.554±0.0142.46Weak Positive 40.5920.5810.6220.598±0.0213.55Negative 10.2350.2180.2200.225±0.0094.15Negative 20.1550.1720.1630.163±0.0095.46Negative 30.2190.2470.2560.240±0.0198.01Negative 40.2690.3170.3050.297±0.0258.44

    Lab 1.新疆畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所;Lab 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室;Lab 3.云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    Lab 1. Veterinary Research Institute of Xinjiang Academy of Animal Sciences; Lab 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine of Shanxi Agricultural University; Lab 3. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory

    3 討 論

    我國(guó)地域遼闊,自然條件復(fù)雜,很多地區(qū)適于各類(lèi)蟲(chóng)媒病毒活動(dòng),新發(fā)和復(fù)發(fā)蟲(chóng)媒病毒病更是隨著近年全球變暖而不斷出現(xiàn)。目前,云南、新疆、山西、內(nèi)蒙古、廣西和廣東等地都報(bào)道檢測(cè)到EHDV陽(yáng)性血清,并從部分省區(qū)分離到病毒,EHD防控形式嚴(yán)峻。

    EHDV血清抗體檢測(cè)是了解EHDV感染情況的必要手段,目前用于EHDV抗體檢測(cè)的方法主要有ELISA、SNT、AGID和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test,CFT)四種。AGID因其簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),過(guò)去曾被大量使用,但存在需對(duì)抗原進(jìn)行高度濃縮,抗原需求量大等缺點(diǎn),且因檢測(cè)EHDV和BTV血清時(shí)存在交叉反應(yīng),所以該試驗(yàn)結(jié)果在BTV和EHDV共存地區(qū)不可靠[15]。CFT在1980年以前一直用于血清檢測(cè),可在病毒感染后4~12個(gè)月定性及定量測(cè)定抗體,但隨后可靠性降低,因此不能用于檢測(cè)老疫區(qū)感染[17]。SNT是目前國(guó)際上抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),有較好的特異性、靈敏度,但有操作要求高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn),并不適于快速診斷和基層單位使用[18]。ELISA具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)樣本通量大、當(dāng)天就能出結(jié)果等優(yōu)點(diǎn),適于大規(guī)模的血清調(diào)查及基層單位使用,已被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)及各類(lèi)疾病診斷等方面[19]。目前,國(guó)外有學(xué)者采用EHDV VP7單克隆抗體(群特異性抗體)建立了血清檢測(cè)的C-ELISA方法[20],國(guó)內(nèi)有學(xué)者用原核表達(dá)VP7蛋白作包被抗原建立間接ELISA方法,但至今已報(bào)道的ELISA方法均無(wú)商品化試劑盒。為能開(kāi)展EHDV血清學(xué)調(diào)查相關(guān)工作,本研究選擇建立能進(jìn)行快速血清檢測(cè)的C-ELISA方法。

    研究初期,由于制備的多株單克隆抗體未達(dá)到使用要求,所以本研究選用豚鼠抗EHDV多抗為競(jìng)爭(zhēng)抗體,以純化滅活后的EHDV作為包被抗原,HPR標(biāo)記的羊抗豚鼠為酶標(biāo)抗體,建立了抗體檢測(cè)的C-ELISA方法。由于多克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)較多,不可能做到徹底阻斷顯色反應(yīng),因此建立的C-ELISA方法可能在敏感性和特異性上不如單克隆抗體方法,但在本研究中,通過(guò)各反應(yīng)條件的優(yōu)化使陽(yáng)性血清最高抗體抑制率達(dá)90%以上,陰性血清抑制率集中在20%以下。

    特異性試驗(yàn)中,該方法僅能檢測(cè)出不同血清型EHDV陽(yáng)性血清,同相關(guān)病毒陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng),特別是與EHDV同源性較高,用AGID試驗(yàn)檢測(cè)常出現(xiàn)交叉反應(yīng)的BTV陽(yáng)性血清,用所建立的C-ELISA方法均能準(zhǔn)確區(qū)分。2016年用該方法對(duì)云南采集的2 737份牛血清進(jìn)行C-ELISA檢測(cè),并從檢測(cè)為陽(yáng)性的血清中隨機(jī)選出700份進(jìn)行血清中和試驗(yàn)確定血清型,結(jié)果存在EHDV-1、2、5、6、7和8不同亞型[9]。結(jié)果說(shuō)明該方法具有較好的群特異性,但由于本實(shí)驗(yàn)室保存的不同亞型EHDV病毒庫(kù)和血清庫(kù)還不完整,特異性試驗(yàn)還需進(jìn)一步完善。

    敏感性試驗(yàn)中,6種不同血清型的EHDV陽(yáng)性血清從1∶10倍開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)瑫r(shí)進(jìn)行C-ELISA、SNT和AGID檢測(cè),C-ELISA能檢出陽(yáng)性的血清最大稀釋度均高于SNT和AGID,且1 d內(nèi)出檢測(cè)結(jié)果,SNT用了7 d,AGID用了3 d,如果無(wú)需確定待檢血清的血清型,ELISA在敏感度和檢測(cè)時(shí)間上都有優(yōu)勢(shì)。

    檢測(cè)監(jiān)控點(diǎn)連續(xù)4年采集的1 980份血清發(fā)現(xiàn),該方法檢出血清轉(zhuǎn)陽(yáng)動(dòng)物及轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間均與SNT、RT-PCR和病毒分離試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)一致,同時(shí)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物被感染后的2~3周內(nèi)為抗體增長(zhǎng)期,抑制率迅速升高,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,至次年4月更換動(dòng)物前抑制率均維持在80%以上,未轉(zhuǎn)陽(yáng)動(dòng)物血清持續(xù)檢測(cè)均為陰性,說(shuō)明該方法具有較好的可靠性和穩(wěn)定性。對(duì)比4種檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在血清抗體增長(zhǎng)期,即核酸檢測(cè)陽(yáng)性后第2周和第3周更易分離到病毒,而核酸陽(yáng)性?xún)H能維持3~4周,所以可以首先選用C-ELISA方法持續(xù)檢測(cè)血清,只需對(duì)血清轉(zhuǎn)陽(yáng)前后5周的抗凝血進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),并將核酸陽(yáng)性血液接種細(xì)胞分離病毒,省去需要對(duì)每次采集的血液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),提高了病毒分離工作效率。對(duì)4年間分離的病毒進(jìn)行基因序列分析和病毒中和試驗(yàn)鑒定存在EHDV-1、2、5、6、7型,詳細(xì)信息另文報(bào)道。批次內(nèi)和批次間重復(fù)試驗(yàn)及在3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室間的再現(xiàn)性試驗(yàn),CV值均小于10%,說(shuō)明該方法有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

    4 結(jié) 論

    建立的C-ELISA方法具有較好的特異性、敏感性、應(yīng)用性及重復(fù)性,為我國(guó)EHDV抗體檢測(cè)提供了一種有效工具,使一些不具備SNT試驗(yàn)條件的地方也能開(kāi)展血清檢測(cè),有助于我國(guó)進(jìn)行EHD的血清調(diào)查和防控。

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