不同毛色牦牛皮膚組織學觀察及MC1R基因功能驗證

唐 朋，凌笑笑，高澤成，賈聰俊，梁春年，吳曉云，褚 敏，閻 萍*

(1. 中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點實驗室，蘭州 730050；2. 甘肅農業(yè)大學動物科技學院，蘭州 730050)

在高寒牧區(qū)，牦牛產毛是其除產肉、產奶外又一重要經濟性狀。由于白毛便于染色，因此它的經濟價值高于其他毛色的毛。毛色既是牦牛品種的標志，亦是決定牦牛毛絨經濟價值的關鍵。因而在牦牛育種中毛色選育具有重要意義。目前，牦牛毛色形成的分子機制鮮有報道，通常大多數牦牛全身被毛呈黑色或夾有少量棕黑色纖維，其中大通牦牛是被毛黑褐色，是以野牦牛為父本，當地家牦牛為母本培育出的肉用型新品種。而天祝白牦牛因其被毛潔白如雪的外貌特征，被譽為“白珍珠”，是世界上稀有的珍貴牦牛遺傳資源。

動物的毛色是研究表型遺傳機制的理想模型[1]。家養(yǎng)動物的毛色作為一種可見性狀，被廣泛用于品種鑒定。在哺乳動物中，動物的毛色取決于真黑素(黑/棕色)和褐黑素(黃/紅)的數量及比例，該開關位點受到由Agouti和Extension基因座分別編碼的鼠灰色基因(Agouti signaling protein gene，ASIP)和黑素皮質素受體1(melanocortin 1 receptor，MC1R)調控。黑色素生成過程中MC1R/ASIP/α-MSH信號通路發(fā)揮重要的作用[2]。已有研究表明，MC1R被視為影響黑色素合成的主控基因之一[3]。細胞膜上MC1R與天然配體激動劑促黑素細胞激素(α-MSH)結合后，活化的G蛋白會激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，經過一系列反應激活酪氨酸酶(TYR)，催化真黑素形成[4]。而ASIP能夠競爭性結合至MC1R，導致真黑色素合成減少，促進褐黑色素生成。此外，小眼畸形相關轉錄因子(MITF)通過與酪氨酸酶啟動子區(qū)域結合而調控TYR的表達，TYR表達上調進而真黑素合成增加[5]。所以，在研究黑色素生成過程中，MC1R基因對毛色生成起到重要的調控作用。

雖然在多種動物中對MC1R基因展開了廣泛而深入研究[6-7]，但對于MC1R是否直接參與影響牦牛毛色及黑色素合成的調控機制卻鮮有報道。因此本試驗以大通牦牛(黑褐色)和天祝白牦牛(白色)為研究對象，首先通過染色初步確定黑色素細胞和黑色素的分布情況，其次通過qRT-PCR分析MC1R基因在兩種毛色牦牛皮膚中的差異表達，最后在細胞水平上探討MC1R與其它毛色相關基因(Agouti、MITF、TYR)和黑色素生成的關系，初步闡明牦牛黑色素沉積的內在調控機理，為牦牛毛色研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 shRNAMC1R干擾載體的構建 將4個靶向MC1R基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆到shRNA載體上，構建成 pAV-4in1shRNA-GFP載體，該表達載體上連有綠色熒光報告蛋白(green fluorescent protein，GFP)，可根據綠色熒光信號強弱判斷轉染效果，shRNA重組干擾載體、陰性對照載體均由山東維真(Vigenebio)生物技術有限公司構建。小鼠黑色素瘤(B16)細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 組織樣采集 分別挑選年齡相近的大通牦牛和天祝白牦牛各6頭，剪掉背部左側被毛并刮凈表皮，用手術刀分離2 cm×5 cm皮膚組織塊，剔除皮下結締組織和脂肪，生理鹽水沖洗干凈后放入液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 甲苯胺藍(Solarbio，中國)，TRIzol、轉染試劑(Invirtrogen，美國)，SYBR Premix Ex TaqⅡ、PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)，冰凍切片組織包埋劑(Sakura，美國)，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、10×Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液(Beyotime，中國)

1.2.2 主要儀器 超速冷凍離心機、NanoDrop 2000(Thermo，德國)，Real-time PCR擴增儀(Bio-Rad，美國)，DYY-6C型平板電泳槽(六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500)、冰凍切片機、普通光學顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、CO2細胞培養(yǎng)箱HF90(Heal force)(Leica，德國)。

1.3 冰凍切片制作及甲苯胺藍染色

1.3.1 冰凍切片的制作 從液氮中取出新鮮組織，用手術刀修剪成1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織塊，置于冰凍切片包埋盒中，加入包埋劑，-20 ℃冰箱冷凍過夜后，進行切片，鏡檢。

1.3.2 甲苯胺藍染色 皮膚組織冰凍塊縱向進行6 μm連續(xù)切片，60 ℃烤片1.5 h；二甲苯透明，梯度酒精(濃度從大～小)復水，蒸餾水洗，0.5%甲苯胺藍溶液染色，蒸餾水洗，梯度酒精(濃度從小～大)脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，鏡檢。

1.4 qRT-PCR檢測基因mRNA相對表達量

1.4.1 總RNA提取和反轉錄 TRIzol法分別提取皮膚組織樣和B16細胞總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定其濃度及純度，選擇A260 nm/A280 nm為1.8～2.0的RNA樣品,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，選擇完整性好的RNA,將其濃度調整為500 ng·μL-1，按照反轉錄試劑盒操作說明，以Oligo(dT)18為引物，采用兩步法合成第一鏈cDNA,-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 引物設計與合成 根據NCBI數據庫中提供的牛β-actin(登錄號：NM_173979.3)和MC1R(登錄號：NM_174108.2)；小鼠β-actin(登錄號：NM_007393.5)，Agouti(登錄號：NM_007427.3)，MITF(登錄號：NM_001113198.1)，MC1R(登錄號：NM_008559.2)、TYR(登錄號：NM_011661.5)基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，然后用NCBI中的BLAST檢測引物特異性，引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成(表1)。

1.4.3 qRT-PCR qRT-PCR反應體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，加水補足至25 μL。每個樣品設計3個重復。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以β-actin為內參基因，通過2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

表1熒光定量PCR引物序列

Table1Primersequencesusedforreal-timePCR

基因名稱Name引物序列(5'→3')Sequence片段大小/bpLengthYak-β-actinF: ACCCAGCACAATGAAGATCAA,R: AACAGTCCGCCTAGAAGCATT176Yak-MC1RF: CTCACCATCCTGCTGGGCGTC,R: CCTGGCTGCGGAAGGCATAGA184Mouse-β-actinF: GAGGGAAATCGTGCGTGAC,R: CGCTCGTTGCCAATAGTGAT147Mouse-MC1RF: CAACTCCAATGCCACCTCT,R: ACAACCAGCACATTCTCCAC132Mouse-AgoutiF: CAGATGGGCGTGGCTCC,R: ACGGGTCGCAGCAAGGTA247Mouse-MITFF: ATCCTGATGGACGATGCC,R: TGCTCCGTTTCTTCTGCG122Mouse-TYRF: AGCCCAGCATCCTTCTTC,R: TAGTGGTCCCTCAGGTGTTC122

1.5 MC1R基因在小鼠黑色素瘤(B16)細胞上的功能驗證

1.5.1 shRNA序列設計 根據GenBank數據庫中小鼠MC1R基因序列信息，設計與合成對目的基因具有特異性的shRNA。雙鏈shRNA設計在靶基因mRNA起始密碼下游120～180 bp至翻譯終止密碼上游50～100 bp查找AA序列，并記錄每個AA 3′ 端連續(xù)相鄰19個核苷酸作為shRNA候選靶位點。其中AA(N19)TT是最理想的序列，若靶mRNA中無此序列，亦可選用NA(N21)。在shRNA 合成時，有義鏈3′ 端需用dTdT代替。最后將候選shRNA序列在GenBank與目的靶基因進行BLAST檢索，與非同源基因具有3個或3個以上堿基相同的序列均可選用。

Mock-shRNA即陰性對照的shRNA，與選中的shRNA序列有相同堿基長度，但與靶基因無明顯同源性。防止特異性shRNA與靶細胞中的其他基因有同源性，將特異性shRNA的序列打亂，再次進行BLAST比對。shRNA重組質粒載體由山東維真(Vigenebio)生物技術有限公司設計合成(表2、圖1)。

表2shRNA干擾片段序列

Table2ParametersoftheshorthairpinRNA(shRNA)

序號No.干擾序列(5'→3')Interference sequence shRNA 1GATCGTGCTGGAGACTACTATCTTCAAGAGAGATAGTAGTCTCCAGCACGATTTTTTTshRNA 2GCGTCTCCAGCACCCTCTTTATTTCAAGAGAATAAAGAGGGTGCTGGAGACGTTTTTTshRNA 3GTCTGCTTCCTGGGCATCATTGTTCAAGAGACAATGATGCCCAGGAAGCAGATTTTTTshRNA 4GAGAATGTGCTGGTTGTGATATTCAAGAGATATCACAACCAGCACATTCTCTTTTTT

圖1 pAV-4in1shRNA-GFP載體結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of pAV-4in1shRNA-GFP vector

1.5.2 B16細胞的培養(yǎng)及轉染 將B16細胞培養(yǎng)于6孔板中，設置試驗組、陰性對照組和空白組。當細胞密度達到50%～60%時，即接種24 h內，添加脂質體和載體的混合物。通過熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡在不同時間點觀察轉染效果。

1.5.3 細胞蛋白提取和Western blot檢測 RIPA蛋白裂解液提取轉染36 h后細胞總蛋白，采用常規(guī)Western blot方法，對MC1R蛋白表達情況進行檢測，并用Quantity one軟件進行蛋白灰度值分析。β-actin作為內參，目的蛋白與內參蛋白比對，進行半定量分析。

1.5.4 黑色素含量測定 收集轉染后各組B16細胞，PBS沖洗2～3次后，0.2 mol·L-1NaOH 溶解細胞，用酶標儀在475 nm波長進行測值，每個樣品重復5次。用烏賊墨標準品作標準曲線[8]。

1.6 數據分析

應用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和Duncan法多重比較。所有數據均以“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 皮膚組織形態(tài)學觀察

大通牦牛與天祝白牦牛皮膚組織冰凍切片能觀察到完整的皮膚結構(圖2A，2D)。進一步放大發(fā)現(xiàn)，牦牛表皮角質層較薄，真皮層較厚(圖2B，2E)，同時觀察到完整的毛囊、毛球等毛干結構，與常見的哺乳動物皮膚組織結構大體相似(圖2C，2F)。通過甲苯胺藍染色可知，大通牦牛和天祝白牦牛的皮膚中均有黑色素顆粒的分布，但含量卻存在差異(圖3a，3d)。大通牦牛和天祝白牦牛表皮和真皮均分布著大量黑色素細胞，黑色素顆粒大量存在于大通牦牛皮膚的表皮層中，而天祝白牦牛只在皮膚表皮基底層檢測到少量黑色素顆粒(圖3b，3e)。大通牦牛毛根、外根鞘、毛髓質有大量的黑色素顆粒存在，毛乳頭黑素色含量較少，而天祝白牦牛只在毛根處檢測到少量黑色素顆粒(圖3c，3f)。

A～C. 大通牦牛；D～F. 天祝白牦牛。A、D. 皮膚組織(100×)；B、E. 表皮層和真皮層(200×)；C、F. 毛干(100×)。1. 表皮；2. 真皮；3. 毛球；4. 毛囊A-C.Datong yak；D-F. Tianzhu white yak. A，D. Skin tissue(100×)；B，E. Epidermis and dermis(200×)；C，F(xiàn). Hair shaft(100×). 1. Epidermis；2. Dermis；3. Hair bulb；4. Hair follicle圖2 不同毛色牦牛皮膚組織冰凍切片F(xiàn)ig.2 The frozen sections without staining in different colors yak skin tissue

a～c. 大通牦牛；d～f. 天祝白牦牛。a、d. 皮膚組織的黑色素分布(100×)；b、e. 皮膚組織表皮和真皮層黑色素及黑色素細胞的分布(200×)；c、f. 皮膚組織毛干黑色素及黑色素細胞的分布(200×)。5. 毛乳頭；6. 黑色素；7. 黑色素細胞a-c. Datong yak；d-f. Tianzhu white yak. a，d. Distribution of melanin in skin tissue(100×)；b，e. Distribution of melanin and melanocytes in epidermis and dermis of skin tissue(200×)；c，f. Distribution of melanin and melanocytes in hair dry of skin tissue(200×). 5. Hair papilla；6. Melanin；7. Melanocytes圖3 不同毛色牦牛皮膚組織甲苯胺藍染色Fig.3 Toluidine blue staining of skin of yak with different coat colors

2.2 不同毛色牦牛皮膚組織MC1R基因的表達

分別以大通牦牛與天祝白牦牛皮膚組織總RNA反轉錄cDNA為模板，經qRT-PCR分析可知，大通牦牛皮膚中MC1R基因的表達量極顯著高于天祝白牦牛(P<0.01)(圖4)。

2.3 MC1R基因干擾效率檢測

2.3.1 細胞熒光信號檢測 觀察12和48 h后

轉染效率可知，與空白對照(圖5A3、B3)相比，轉染12 和48 h后，試驗組(MC1R干擾載體)和陰性對照組(空載體)均具有較強的熒光信號(圖5A1～A2，B1～B2)。光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)結構可知，轉染12 和48 h后，細胞沒有結構形態(tài)的變化，并能在視野中觀察到黑色素的分布(圖5C1～C3，D1～D3)，表明轉染成功。

**代表組間差異極顯著(P<0.01)。下同** mean very significantly differences between the groups (P<0.01).The same as below圖4 不同毛色牦牛MC1R mRNA差異表達Fig.4 Differential expression of MC1R mRNA in yak with different coat colors

2.3.2 qRT-PCR和Western blot檢測MC1R基

因的干擾效率 qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，干擾效果明顯(圖6)。Western blot結果表明，與對照組相比，試驗組MC1R蛋白的表達量極顯著降低。綜上可知，在MC1R基因轉錄和翻譯水平上，試驗組均極顯著低于空白及陰性對照組(P<0.01)(圖7)，說明MC1R基因干擾成功。

2.4 MC1R基因干擾后對相關基因表達及黑色素合成的影響

2.4.1 黑色素合成通路相關基因的檢測 由圖8可知，干擾MC1R基因后，TYR基因表達水平極顯著下調(P<0.01)；MITF表達水平顯著下調(P<0.05)；而Agouti基因沒有顯著變化?？瞻捉M與陰性對照組相比，只有MITF基因出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

A1～A3.轉染12 h熒光顯微鏡下觀察到的細胞；B1～B3.轉染48 h熒光顯微鏡下觀察到的細胞；C1～C3.光學顯微鏡與A1～A3相同視野的對照；D1～D3.光學顯微鏡與B1～B3相同視野的對照。A1、B1、C1、D1. 陰性對照；A2、B2、C2、D2. 試驗組；A3、B3、C3、D3. 空白對照?！?黑色素A1-A3. The cells observed by fluorescence microscope 12 h after transfection；B1-B3. The cells observed by fluorescence microscope 48 h after transfection；C1-C3. The control of the same view of ordinary light microscope as A1-A3；D1-D3.The control of the same view observed by ordinary light microscope as B1-B3. A1，B1，C1，D1. Negative control；A2，B2，C2，D2. The treatment group；A3，B3，C3，D3. Blank control.↑.Melanin圖5 B16細胞的轉染效率(100×)Fig.5 The transfection efficiency in B16 cells(100×)

2.4.2 細胞黑色素濃度測定 轉染后，對各個時間點的細胞進行黑色素含量測定，結果顯示，整個轉染期間試驗組黑色素濃度均處在較低水平，在24 和36 h時濃度最低，與空白和陰性對照組相比差異極顯著(P<0.01)；在12、48和60 h濃度較低，與空白和陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)。各時間點的空白組與陰性對照組均差異不顯著(P>0.05)(圖9)。

3 討 論

3.1 兩種牦牛不同毛色的組織形態(tài)學比較

甲苯胺藍是一種堿性染料，可將皮膚組織中存在的大量角化細胞和角化蛋白著色，因此本試驗采用甲苯胺藍染色后發(fā)現(xiàn)，大通牦牛和天祝白牦牛皮膚黑色素細胞均分布在表皮基底部和毛囊外根鞘部，這與文獻報道一致[9]。黑色素細胞是黑色素的生產者，產生的黑色素從黑色素細胞樹枝突沿途分送給角質形成細胞。有研究者根據黑色素細胞分布部位將其分為3類：第1類分布在表皮，它們只有少

BC. 未作轉染的空白對照組；NC. 轉染空載體的陰性對照組；MC1R-shRNA. 轉染MC1R干擾載體的試驗組。*代表組間差異顯著(P<0.05)，**代表組間差異極顯著(P<0.01)。下同BC. Blank control group without transfection；NC. Negative control group transfected with empty vector；MC1R-shRNA. The treatment group transfected with MC1R interference vector. * mean significant differences among the groups (P<0.05), ** mean very significantly differences among the groups (P<0.01).The same as below圖6 轉染后MC1R mRNA的差異表達Fig.6 Differential expression of MC1R mRNA after transfection

1. BC；2. MC1R-shRNA；3. NC圖7 轉染后MC1R蛋白的差異表達(A)和灰度值分析(B)Fig.7 Differential expression level (A) and the gray value(B) of MC1R protein after transfection

圖8 MC1R基因沉默后B16細胞各基因的表達Fig.8 Expression of genes in B16 cells after MC1R gene silencing

圖9 不同時間點黑色素濃度測定Fig.9 Detection of melanin content at different time points

量黑色素沉積；第2類分布于毛囊外根鞘中，細胞形態(tài)較小，沒有黑色素分泌，但能夠增殖分化；第3類分布于毛球部，形態(tài)較大并且可分泌大量黑色素，但不能增生分化[10-11]。而不同部位黑色素細胞產生的黑色素顆粒有著不同的功能，可能是由于調控機理或是傳導運輸機理不同導致的[12]。有研究證明，哺乳動物毛發(fā)著色主要來源于毛球部毛母質細胞間成熟黑色素細胞合成的色素[13]，而與毛囊所在皮膚組織中黑色素細胞的數量以及成熟度無關[14]。皮膚的顏色決定于表皮細胞內黑色素的多少，而不決定與黑色素細胞的數目[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大通牦牛和天祝白牦牛均具有完整的皮膚結構，且大通牦牛的毛囊周圍和表皮基底層存在大量黑色素，而天祝白牦牛只在表皮層檢測到少量黑色素。推測其與牦牛毛色差異相關。

3.2 MC1R的表達差異

MC1R基因作為控制毛色的重要候選基因之一，在黑色素合成過程中起著重要的調控作用[16]。通過對6種毛色獺兔皮膚中MC1R基因表達量檢測發(fā)現(xiàn)，黑色表達量最高，黃色獺兔表達量最低[17]。秦珂等[18]通過檢測陸川豬等8個豬種MC1R基因的基因型，證實了中外豬種間在毛色遺傳上的分子差異。不同毛色綿羊皮膚組織均正常表達MC1R基因，但其表達水平存在差異，全黑綿羊皮膚中MC1RmRNA和蛋白的表達量顯著高于其它3種毛色綿羊[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MC1R在大通牦牛皮膚組織中的表達量極顯著高于天祝白牦牛(P<0.01)，與前人在其他物種上研究結果一致，可見MC1R基因對色素形成和沉積起著重要作用，因此選擇MC1R基因作為后續(xù)研究對象。

3.3 MC1R的功能初步研究

小鼠黑色素瘤細胞(B16)是源自C57小鼠的一種皮膚癌細胞，常被用作研究腫瘤發(fā)生機制和抗腫瘤藥物的試驗模型。B16細胞因其在體外培養(yǎng)也具備合成黑色素顆粒的能力[20-21]，也被用來篩選促黑劑嘗試治療白癜風或白化病。本試驗中，筆者在體外構建特異性干擾MC1R的shRNA重組質粒載體，重點研究MC1R是否參與黑色素生成。使用RNAi技術研究基因功能，為治療基因相關疾病提供了一個有效的途徑[22]，孫笑尉等[23]通過將MC1RsiRNA瞬時轉染羊駝黑色素細胞后發(fā)現(xiàn)，黑色素生成量有明顯的變化，推測MC1R與皮膚黑素細胞的黑色素生成有著密切的關系。賈秀華[24]在體外構建干擾TYR的質粒載體，通過抑制酪氨酸酶的活性進而降低黑色素的合成。竇克軍和孫春寶[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默MC1R基因能下調TYR基因的表達，影響多巴的合成，進而黑色素生成減少。有研究表明，在MC1R功能喪失或MC1R受到與其拮抗的ASIP抑制時，TYR不能被激活而保持較低活性，導致真黑色素含量降低，出現(xiàn)棕色或紅色等較淺的毛色性狀[13]。本研究在細胞水平利用特異性shRNA抑制MC1R基因的表達后，發(fā)現(xiàn)MITF基因在空白組和陰性對照組表達量差異顯著，可能是由于轉染試劑對細胞破壞導致的。而抑制MC1R顯著降低了TYR基因的表達和黑色素的合成。其原因可能是MC1R作為調控黑色素的形成過程中的關鍵靶基因，直接影響黑色素的合成。也可能是MC1R通過調控下游TYR基因的表達，進一步調控黑色素的合成。本試驗結果表明，MC1R參與調控黑色素合成，但具體的分子機制還有待后續(xù)研究。

4 結 論

本研究表明，大通牦牛與天祝白牦牛皮膚中的黑色素顆?？赡苁菍е玛笈Ｃ町惖脑?。細胞水平上驗證發(fā)現(xiàn)，MC1R通過調控下游TYR的活性影響B(tài)16細胞的黑色素合成，推測大通牦牛皮膚黑色素高度沉積可能與MC1R、TYR的表達量有關。本試驗為牦牛黑色素合成的分子機制提供一定的理論依據。