犬源糞腸球菌的分離與鑒定

陸璐，張希墨，劉燕霏，楊建德

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犬源糞腸球菌的分離與鑒定

陸璐，張希墨，劉燕霏，楊建德通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380）

隨著都市寵物業(yè)的發(fā)展，伴侶動(dòng)物的化膿性疾病日趨增多。為探究其影響病原，本研究對(duì)一例犬子宮蓄膿的濃汁進(jìn)行了病原學(xué)鑒定。利用細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法對(duì)采集到的病料進(jìn)行分離純化、涂片染色、鏡檢和生化鑒定，然后采用16S rRNA基因序列分析鑒定，發(fā)現(xiàn)該分離株的形態(tài)特征、生化結(jié)果與糞腸球菌一致，分離菌株的16S rRNA也與參考的糞腸球菌菌株同源性高達(dá)99%。藥敏試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)四環(huán)素、青霉素G、米諾環(huán)素、紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萬古霉素、左氟沙星、克林霉素、多粘菌素B、氯霉素、復(fù)方新諾明和克拉霉素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)苯唑西林和呋喃妥因敏感。這些研究結(jié)果可為治療此類多重耐藥性腸球菌感染提供參考。

糞腸球菌；生化鑒定；進(jìn)化樹分析；藥敏試驗(yàn)

糞腸球菌又稱糞鏈球菌，革蘭氏染色為陽性，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要菌群之一[1]。糞腸球菌能在不同環(huán)境中生長(zhǎng)存活，常定居于動(dòng)物腸道、口腔、生殖道，其能產(chǎn)生天然抗生素，有利于機(jī)體健康[2]。以往認(rèn)為糞腸球菌是人類及動(dòng)物的共生菌，但在近十幾年來糞腸球菌已逐漸成為人體內(nèi)革蘭氏陽性菌感染僅次于葡萄球菌的第二大病原菌[3]。糞腸球菌能夠頻繁地引起人類的廣泛感染，醫(yī)院內(nèi)病人感染和死亡的病例數(shù)逐漸增加，尤其見于免疫力低下或患有危重基礎(chǔ)疾病患者[4]。這些機(jī)體感染大多數(shù)發(fā)生在泌尿道、血液循環(huán)、心內(nèi)膜腹腔、膽管、燒傷處及類似組織等。腸球菌還能感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、軟組織、鼻旁竇、眼和牙周組織，但這些組織感染頻率較低[5]。在許多歐美國家，糞腸球菌感染嚴(yán)重威脅著人類公共健康，在中國也已從豬、羊等動(dòng)物體內(nèi)分離到致病性糞腸球菌[6]。近年來，動(dòng)物感染糞腸球菌發(fā)病和死亡的報(bào)道也日益增多，常引起公豬睪丸炎、雞敗血癥、牛乳腺炎、犢牛或羔羊心內(nèi)膜炎及犬尿道感染等疾病[7]?？咕幬锏拇罅渴褂?，使糞腸球菌進(jìn)化出許多針對(duì)抗生素的機(jī)制，并產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)的耐藥機(jī)制[8]。

本試驗(yàn)采集患病犬的子宮蓄膿膿汁，經(jīng)分離培養(yǎng)獲得一株細(xì)菌，命名為E f-lu，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、菌株16S rRNA的擴(kuò)增與測(cè)序分析。

1 材料與方法

1.1 病料

患病犬為送往天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院的10歲雌性德國牧羊犬，癥狀表現(xiàn)為陰道分泌物呈黃色，氣味難聞，腹圍略增大。手術(shù)切除其蓄膿子宮，無菌采集膿汁用于病原分離。

1.2 主要試劑

1.2.1 培養(yǎng)基和生化鑒定管

制備普通肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均按常規(guī)方法[9]制備。鏈球菌鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2.2 藥敏紙片

藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將膿汁無菌接種于培養(yǎng)基上，然后挑選出優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，分別在普通營養(yǎng)瓊脂平板和哥倫比亞瓊脂平板劃線，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 涂片染色鏡檢

挑取分離的單個(gè)菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，置于油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)排列及染色特性，染色方法按照文獻(xiàn)[10]要求進(jìn)行。

1.3.3 生化特性鑒定

生化試驗(yàn)參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，用分離菌的純培養(yǎng)物分別接種于精氨酸、蔗糖、七葉苷、VP試驗(yàn)等生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果。

1.3.4 分離菌株16S rRNA同源性分析與進(jìn)化樹構(gòu)建

將獲得菌株送往上海生工公司測(cè)16S rRNA基因序列，將獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast相似性搜索，獲取與分離株16S rRNA序列最為相近的序列。采用DNAstar軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

采用平板表面散布法。將分離菌株的肉湯純培養(yǎng)物100 μL（109CFU）均勻地涂抹于事先準(zhǔn)備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，再將藥敏片貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，貼好紙片的平板于37 ℃ 溫箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察和測(cè)量藥敏試驗(yàn)的抑菌圈直徑，記錄結(jié)果，分析其藥物敏感情況。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)特性、細(xì)菌形態(tài)及染色特性

經(jīng)過分離培養(yǎng)所得細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂中，形成乳白色、不透明、表面光滑、邊緣整齊的圓形小菌落，見圖1，哥倫比亞瓊脂菌落稍大，在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。涂片染色，鏡檢為革蘭氏陽性球菌，多呈雙球狀排列，亦有少數(shù)為單個(gè)存在，見圖2。

圖1 分離培養(yǎng)結(jié)果

圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

髓鞘關(guān)聯(lián)糖蛋白、精氨酸、蔗糖、曲美他嗪、蕈糖、七葉苷、VP試驗(yàn)為陽性；DP試驗(yàn)、草甘膦、山梨醇為陰性。參考標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化特性，該分離菌株與腸球菌一致，故初步判定為腸球菌。詳情見表1。

表1 分離菌生化特性試驗(yàn)結(jié)果

注：“＋”為產(chǎn)酸；“－”為不分解

2.3 16S rRNA同源性結(jié)果分析

將此序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast對(duì)比，與糞腸球菌屬的相似性高達(dá)100%。將分離菌株16S rRNA的基因序列經(jīng)DNAstar軟件分別與數(shù)據(jù)庫中16S rRNA進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，分離菌株的16S rRNA序列與糞腸球菌具有高度的同源性，同源性均為99%以上。見圖3。

注：左下角數(shù)據(jù)為遺傳距離，右上角數(shù)據(jù)為同源性

2.4 16S rRNA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果

將分離菌株的16S rRNA序列經(jīng)DNAstar軟件中的MegAlign分別與10株數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果見圖4。分離菌株E f-lu與數(shù)據(jù)庫中的EU794735.1和MF369842.1親緣性最近，而與MG543833.1和KP090135.1親緣性相對(duì)較遠(yuǎn),與EU708623.1，KM497509.1，KP090135.1和MG543833.1同源性最高，均為99.5%。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定了該菌對(duì)萬古霉素、米諾環(huán)素、氯霉素、苯唑西林、克林霉素等抗生素的耐藥性，顯示該菌株對(duì)于所有本試驗(yàn)測(cè)定的藥物基本上全耐藥，只對(duì)苯唑西林和呋喃妥因敏感。詳見表2。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

藥品名稱藥物含量判斷標(biāo)準(zhǔn)/mm抑菌圈直徑結(jié)果耐藥中介敏感μgmm 克拉霉素15≤1314～17≥180R 四環(huán)素30≤1415～18≥190R 米諾環(huán)素30≤1213～15≥167R 諾氟沙星30≤1213～16≥170R 環(huán)丙沙星5≤1415～21≥220R 左氟沙星5≤1314～16≥170R 多粘菌素B100≤89～11≥120R 復(fù)方新諾明30≤1011～15≥160R 呋喃妥因100≤1415～16≥1717S

注：“R”表示耐藥，“S”表示敏感

3 討論

糞腸球菌可引起泌尿生殖道感染、菌血癥、敗血癥、創(chuàng)傷感染、心內(nèi)膜炎和皮膚軟組織感染等疾病[5]，在2010—2014年，江丹英等[11]從其所在醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離出1 220株腸球菌，其中糞腸球菌675株（55.3%），屎腸球菌445株（36.5%）。雖然糞腸球菌在臨床感染中占優(yōu)勢(shì)地位，但在犬臨床子宮蓄膿疾病中卻很少出現(xiàn)。2013年，石翠云對(duì)43例犬子宮蓄膿進(jìn)行了病原學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)分離到的主要是革蘭氏陰性桿菌，其中絕大部分是腸桿菌科成員，少部分是假單細(xì)胞菌屬的銅綠假單胞菌；也有革蘭式陽性球菌，包括糞腸球菌和葡萄球菌，但其比例僅占子宮蓄膿總數(shù)的15%[12]。

本次試驗(yàn)從犬子宮蓄膿膿汁分離出的糞腸球菌，通過藥敏試驗(yàn)測(cè)定，對(duì)萬古霉素、米諾環(huán)素、克拉霉素、氯霉素等耐藥，只對(duì)苯唑西林和呋喃妥因敏感，為多重耐藥菌株。連頑固性耐藥的萬古霉素也被糞腸球菌攻破，這引起了中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)對(duì)其高度重視[13]。

由于糞腸球菌普遍存在于豬群、羊群、牛群、禽飼養(yǎng)場(chǎng)、醫(yī)院及動(dòng)物診所中，長(zhǎng)期的抗菌素使用不當(dāng)，導(dǎo)致糞腸球菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，使治療糞腸球菌感染越來越困難。目前，用于預(yù)防糞腸球菌病的疫苗還未普及，還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段[14]。多重耐藥菌可在人類、動(dòng)物和環(huán)境之間傳播，使細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)重，可對(duì)人類公眾健康造成嚴(yán)重威脅[15]。因此，治療糞腸球菌感染不僅要闡明其主要的致病機(jī)理，還需加強(qiáng)人和動(dòng)物抗菌素的合理、規(guī)范使用。

[1] 王亞賓，陳麗穎，胡慧，等. 豬源糞腸球菌和屎腸球菌多重PCR快速鑒定方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31（8）：1123-1127.

[2] Malik R K，Montecalvo M A，Reale M R，et al. Epidemiology and control of vancomycin-resistant enterococci in a regional neonatal intensive care unit[J]. Pediatr Infect Dis J，1999，18（4）：352.

[3] Toledo-Arana A，Valle J，Solano C，et al. The enterococcal surface protein，Esp，is involved inbiofilm formation[J]. Appl Environ Microbiol，2001，67（10）：4538-4545.

[4] Creti R，Imperi M，Bertuccini L，et al. Surver for virulence determinants amongisolated from different sources[J]. J Med Microbiol，2004，53：13-20.

[5] 劉燕霏，楊建德，趙瑞利. 糞腸球菌動(dòng)物致病的研究進(jìn)展[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，34（11）：75-77.

[6] 王亞賓，陳麗穎，張紅英，等. 感染仔豬糞腸球菌不同分離株的鑒定及毒力基因的檢測(cè)[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2010，30（5）：615-619.

[7] Ana R F，Ana P T，Carla N，et al. Global spread of the hylemf colonization virulence gene plasmids of theCC17 polyclonal sub cluster[J]. Chemother，2010，54（6）：2660-2665.

[8] 王送林，李蕓芳，劉秋菊，等. 湖南省豬源糞腸球菌耐藥性分析[J]. 中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2015，23（2）：41-46.

[9] 胡桂學(xué)，廖明，彭遠(yuǎn)義，等. 獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[10] 崔保安，牛鐘相，任家，等. 動(dòng)物微生物學(xué)[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[11] 江丹英，林雪峰，王兵勇，等. 醫(yī)院感染腸球菌的臨床分布及耐藥性分析[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，53（35）：99-102.

[12] 石翠云. 43例犬子宮蓄膿細(xì)菌的分離及子宮壁病理組織學(xué)與免疫組化變化的研究[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2016.

[13] 胡付品，朱德妹，汪復(fù). 2011年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國感染與化療雜志，2014，14（5）：365-374.

[14] 呂娜，高原. 糞腸球菌致病因子的研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，30（4）：323-326.

[15] 王娟，王新華，徐海. 多重耐藥菌在人類、動(dòng)物和環(huán)境的耐藥和傳播機(jī)制[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2016，56（11）：1671-1679.

責(zé)任編輯：張愛婷

Isolation and identification of canine

LU Lu，ZHANG Xi-mo，LIU Yan-fei，YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

With the development of the urban pet industry, suppurative diseases of companion animals are increasing day by day.To explore its associated pathogens, this study was performed on etilolgical identification from a case of a canine uterus with pus. Bacteriological detection method was used to isolate and purify the collected disease materials, such as smear staining, microscopic examination and biochemical identification. Then, 16S rRNA molecular sequence analysis was used to identify the the isolated strain. It was found that the morphological features of the isolated strain and the biochemical results were consistent with the. The 16S rRNA of the isolated strain was also as high as 99% homologous with the reference stains. Drug susceptibility test showed that the isolate was resistant to tetracycline, penicillin G, minocycline, erythromycin, ciprofloxacin, norfloxacin, vancomycin, levofloxacin, clindamycin, polymyxin B, chloramphenicol, compound sulfamethoxazole, and clarithromycin, and only sensitive to oxacillin and nitrofurantoin. These results provided a reference for the treatment of this type of multidrug-resistant enterococcal infection.

; biochemical identification; evolutionary tree analysis; drug sensitive test

S852.611

A

2018-01-30

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201710061193）；天津自然科學(xué)基金項(xiàng)目（07JCYBJC16000）；天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院項(xiàng)目（ZH004903）

陸璐（1997-），女，本科在讀，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方面研究。E-mail：1043146254@qq.com。

楊建德（1969-），男，教授，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方面的教學(xué)與研究。E-mail：jiandeyang@126.com。

1008-5394（2018）02-0047-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.012