microRNA在肥胖相關(guān)腎病發(fā)生的臨床應(yīng)用△

崔勝金 陳澤衍 郭偉權(quán) 周義文

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院 深圳 518101)

肥胖相關(guān)性腎病是臨床常見的腎病類型，各年齡段均可發(fā)病，青壯年多發(fā)，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示70%患者發(fā)病年齡在44歲以下，且男性患者發(fā)病率略高于女性，患者患病后除了有明顯蛋白尿，同時(shí)存在腎小球肥大或硬化情況[1～2]。目前臨床主要通過藥物改善患者腎臟功能、控制病情發(fā)展，近幾年臨床一直在研究疾病發(fā)病機(jī)制，希望從中找到防治疾病的靶點(diǎn)，并通過藥物靶點(diǎn)作用達(dá)到治療效果。miR是一種RNA在生物體的器官形成、細(xì)胞增殖、凋亡及部分疾病的發(fā)生中發(fā)揮作用[3]。在相關(guān)研究中miR-192在腎臟組織中高表達(dá)，且糖尿病腎病(DA)者纖維化腎小球中miR-192表達(dá)水平顯著低于無(wú)纖維化組織，其認(rèn)為miR-192可能參與DA發(fā)病，故臨床認(rèn)為miR可能在腎病發(fā)生中發(fā)揮作用。CTNNBIPl是一種結(jié)合蛋白，有研究表明其使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，能與Tcf/fLef轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄共激活子CPB/p300競(jìng)爭(zhēng)性地與β-catenin結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)信號(hào)途徑。本文通過觀察db/db小鼠腎組織中miR-215表達(dá)，查詢其調(diào)控的靶基因，證實(shí)其與靶基因的關(guān)系，觀察靶基因表達(dá)，從而分析miR在疾病發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑

miR-215模擬物及對(duì)照，羊抗ICAT抗體(CTNNBIP1)，Cy3標(biāo)記的miR陰性對(duì)照，小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊IgG和抗生物素-辣根過氧化物酶抗體，實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒、熒光素酶報(bào)告基因載體pmiR-REPORT質(zhì)粒等。

1.1.2實(shí)驗(yàn)物

雄性小鼠36只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 SPF級(jí))，其中db/m小鼠、db/db小鼠各18只，且均為4周齡。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)物處理

兩組小鼠均于SPF清潔級(jí)層流室中飼養(yǎng)，小鼠可自由進(jìn)食、進(jìn)水，于小鼠8、12、16周齡時(shí)，隨機(jī)在兩組各抽6只處死，開腹取出腎臟，清除腎門處血管等結(jié)締組織，將腎組織以液氮保存。

1.2.2miR-215靶基因預(yù)測(cè)

使用Targetscan、Pictar及和miRNA.org預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-215靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，找出3個(gè)軟件預(yù)測(cè)交集的靶基因，并通過過GO注釋分析靶基因的生物學(xué)功能，進(jìn)而找出相關(guān)靶基因。

1.2.3構(gòu)建miR-CTNNBIPl-3'UTR質(zhì)粒

參考Targetscan軟件中CTNNBIPl-3'UTR序列，以Primer Premier0軟件對(duì)成PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，將限制性內(nèi)切酶SpeI(ACTAGT)與HindⅢ(AAGCTT)識(shí)別位點(diǎn)分別加入上、下游引物中，序列為5'-GCGCACTAGTTCTTGACCAACGGAAAC-3'，5'-GCGCAAGCTTACCTACAGCCAATCAAAG-3'。提取培養(yǎng)MMC RNA，并在反轉(zhuǎn)錄后將可能與miR-215序列結(jié)合的位點(diǎn)片段，行CTNNBIPl-3'UTR PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后與Spe I與Hind Ⅲ雙酶切pmiR-REPORT載體相連。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，并以Spe I、HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行克隆測(cè)序，選擇其中測(cè)序正確的質(zhì)粒，完成miR-CTNNBIPl-3'UTR質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.2.4測(cè)雙熒光素酶活性

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種，在細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%后行基因轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染劑分別加入4組中，1組(pmiR-REPORT+pRL-TK質(zhì)粒+miR-control)、兩組(pmiR-REPORT+pRL-TK質(zhì)粒+miR-215 mimics)、3組(pmiR-CTNNBIPl-3'UTR+pRL-TK質(zhì)粒+miR-control)、4組(pmiR-CTNNBIPl-3'UTR+pRL-TK質(zhì)粒+miR-215 mimics)，轉(zhuǎn)染1d后測(cè)酶活性，以螢火蟲與海腎熒光活性的比值表示相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.5PCR法

小鼠腎臟組織RNA提取按照Trizol說明書行腎組織RNA提取，應(yīng)用超微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，取等量0.5μl RNA按試劑盒說明書行反轉(zhuǎn)錄，以采用PCR系統(tǒng)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)束后行熔解曲線分析，確定PCR擴(kuò)增特異性，得出的ct值并按公式求出基因表達(dá)的相對(duì)變化量，重復(fù)3次。

1.2.6Westernblot法

根據(jù)SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組小鼠小鼠腎組織中miR-215、CTNNBIPl的表達(dá)變化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-215、CTNNBIPl水平表達(dá)

結(jié)果顯示觀察組小鼠隨著周齡增加組織中miR-215表達(dá)上升，P<0.05；對(duì)照組無(wú)明顯變化，同時(shí)隨著周齡增加觀察組CTNNBIPl表達(dá)下降，P<0.05，見圖1。

2.2 miR-215、CTNNBIPl的關(guān)系

結(jié)果顯示4組熒光素酶相對(duì)活性低于其他3組，4組熒光表達(dá)強(qiáng)度低，P<0.05，見圖2。

圖2 熒光素酶活性

3 討論

miR是一類具有高度保守表達(dá)的新型RNA片段，其通過與基因mRNA的3'-UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而對(duì)基因mRNA特性進(jìn)行降解，進(jìn)而參與調(diào)控下游靶基因表達(dá)，臨床認(rèn)為通過對(duì)這些能特異性表達(dá)的miR進(jìn)行分析，能對(duì)一些疾病防治起到重要作用[5]。肥胖相關(guān)性腎病是臨床一種因患者肥胖所引發(fā)的腎臟疾病，特征為持續(xù)性蛋白尿、腎小球?yàn)V過率增高，疾病可致患者腎小球病變(單純肥大、硬化)，若不及時(shí)治療患者預(yù)后較差，5 年腎存活率僅為77%，10 年為51%，因此如何有效防治疾病得到臨床的重視[6]。

早前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-192在腎臟組織中能特異性表達(dá)，其通過調(diào)控靶基因SIPl、ZEBI表達(dá)，來參與腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚的過程，其水平高度表達(dá)有促腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的作用[7]。miR-215與miR-192具有共同的“種子序列”，故推測(cè)其可能具有與miR-192相似的病理作用，本次結(jié)果顯示小鼠肥胖相關(guān)性腎病形成過程中，觀察組腎組織miR-215表達(dá)上升，呈明顯的時(shí)間依賴性，且與對(duì)照組miR-215表達(dá)有明顯差異，提示miR參與肥胖相關(guān)性腎病的形成[8]。同時(shí)通過用生物信息學(xué)分析，其相關(guān)調(diào)控靶基因?yàn)镃TNNBIPl，CTNNBIPl是一種結(jié)合蛋白，有研究表明其是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，能通過競(jìng)爭(zhēng)性地與β-catenin結(jié)合，對(duì)Wnt-β-catenin信號(hào)途徑進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，而Wnt-β-catenin途徑下游靶基因與腎小球纖維化機(jī)制、系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)、維持密切相關(guān)，故臨床認(rèn)為miR可能通過調(diào)節(jié)CTNNBIPl來參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[9]。

本次結(jié)果顯示隨著周齡增加觀察組CTNNBIPl表達(dá)下降，且與對(duì)照組CTNNBIPl表達(dá)有明顯差異，同時(shí)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示。轉(zhuǎn)染miR-215可抑制基因熒光素酶的表達(dá)活性，提示CTNNBIPl的表達(dá)受到miR-215負(fù)性調(diào)控，隨著miR-215表達(dá)上調(diào)，CTNNBIPl表達(dá)逐漸下降，從而使肥胖性腎病患者病程中Wnt-β-catenin途徑處于激活狀態(tài)，進(jìn)而促纖維細(xì)胞因子表達(dá)，臨床表現(xiàn)為腎小球的逐漸硬化[10]。

綜上所述，miR-215可能通過調(diào)控CTNNBIPl靶基因表達(dá)，從而參與肥胖相關(guān)性腎病的形成，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍有待進(jìn)一步深入研究，若得到證實(shí)miR-215可能成為早期疾病診斷、判斷預(yù)后的有效標(biāo)志物。