液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中紅霉素殘留的技術(shù)研究

朱志強 曾 智 童文羽

紅霉素（Erythromycin，EM）是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要應用于治療由格蘭氏陽性菌和部分格蘭氏陰性菌引起的疾病。近年來，它在養(yǎng)殖業(yè)，包括水生生物中也得到應用。由于該藥物在生物體內(nèi)的代謝時間較長，因此容易產(chǎn)生殘留。目前水產(chǎn)品中紅霉素的殘留主要用GB 29684-2013國家標準進行檢測，本文在此標準的基礎上進一步優(yōu)化了前處理方法，提高了檢測效率，并且能夠達到規(guī)定的重現(xiàn)性和準確性。本試驗通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），多反應監(jiān)測掃描模式（MRM）和同位素內(nèi)標法定量，對草魚、中華鱉、對蝦等水產(chǎn)品中的紅霉素進行了檢測。

1 實驗材料

1.1 儀器 AB QTRAP4500液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）、勻漿機、離心機、超聲波清洗儀、垂直振蕩器、氮吹儀等。

1.2 材料 草魚、中華鱉、對蝦等水產(chǎn)品，采自于養(yǎng)殖場和農(nóng)貿(mào)市場，去皮去骨去內(nèi)臟取可食部分切碎、混勻、冷凍，作為樣品備用。

1.3 試劑和藥品 甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國Merck（默克）公司；正己烷（分析純），國藥集團。

表1 梯度洗脫液比例

表2 紅霉素（EM）和紅霉素同位素內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 標準品 紅霉素（EM）標準品（德國Dr公司）、紅霉素同位素標準品（美國CIL氘代試劑)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18柱（1.9μm×2.1mm×50mm）;柱溫40℃；進樣量10.0μL；流動相0.2%甲酸乙腈溶液和0.2%甲酸水溶液，流速0.4mL/min,運行時間10min（見表1）。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監(jiān)測掃描模式（MRM）；霧化器、碰撞器為氮氣。質(zhì)譜參數(shù)見（表2）。

3 實驗步驟

3.1 標準溶液的配置

紅霉素標準儲備液（100.0μg/mL）用甲醇配置，紅霉素標準中間工作液（0.5μg/mL）用甲醇稀釋；紅霉素同位素標準使用液（200.0ng/mL）用甲醇稀釋。準確量取一定量的紅霉素標準中間工作液，用30%的甲醇稀釋成濃度為5.0ng/mL、15.0ng/mL、25.0ng/mL、35.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL的標準系列使用液，氘代紅霉素的濃度均為10.0ng/mL。

3.2 樣品前處理

表3 標準工作曲線

準確稱量5.00g勻漿樣品，置于50mL離心管中，加入200ng/mL的內(nèi)標標準溶液50.0μL，加入10mL乙腈，垂直振蕩1min，超聲5min，然后4500轉(zhuǎn)離心5min，取上清液至另一50mL離心管中，重復提取一次，合并提取液，加入15mL正己烷振蕩1min，4500轉(zhuǎn)離心5min，棄去正己烷，取下層溶液10mL40℃氮吹吹干，加入1.0mL30%甲醇，渦旋，再加入2mL正己烷渦旋30秒，4500轉(zhuǎn)離心5min，棄去正己烷，樣液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后，待上機分析。

表4 紅霉素的添加濃度及其平均回收率的實驗數(shù)據(jù)（n=3）

3.3 樣品加標回收率的測定

準確稱取紅霉素的陰性樣品5.00g，添加濃度為0.5μg/mL的紅霉素使用液10μL、50μL、200μL共3組，加入濃度為200.0ng/mL的內(nèi)標標準溶液50.0μL，每組3個平行樣。

4 結(jié)果與討論

4.1 紅霉素的標準工作曲線

按上述色譜和質(zhì)譜條件測定一系列6個質(zhì)量濃度的紅霉素的標準曲線，以標準物質(zhì)的質(zhì)量濃度與內(nèi)標物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標，標準物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標物的峰面積之比為縱坐標，繪制標準工作曲線，線性范圍為5.0～200.0ng/mL，線性方程為y=0.13798x+0.08726，線性相關(guān)系數(shù)為0.99966，定量限為1.0μg/kg（見表3）。

4.2 不同水產(chǎn)品中紅霉素含量的檢測結(jié)果（見表4）

紅霉素檢測的線性范圍為5.0～200.0ng/mL，定量限為1.0μg/kg，在加標量為5.0μg/kg、25.0μg/kg、100.0μg/kg時，樣品加標回收率均在80%～120%之間，相對標準偏差（RSD）均小于10.0%（不同水產(chǎn)品加標量為100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖見圖1-3）。

4.3 結(jié)論

目前水產(chǎn)品中紅霉素的殘留量主要按照國家標準GB 29684-2013進行檢測，此方法在實際操作中步驟較為繁瑣，前處理時間較長，且存在一定的污染風險。本實驗優(yōu)化了前處理方法，用氮吹取代旋蒸，同時簡化操作步驟，節(jié)省操作時間，且檢測結(jié)果均能滿足檢測要求，提高了檢測效率。

圖1 草魚添加100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖

圖2 中華鱉添加100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖

圖3 對蝦添加100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖