黑蒜促進(jìn)血管生成作用

盛文龍,武 云,劉發(fā)生,李娟娟,靳 夢(mèng),何秋霞,韓 兵,黃金棟,韓利文,*,劉可春,*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所,山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省生物檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250103;2.萊蕪裕源食品有限公司,山東萊蕪 271100)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口老齡化的加劇,心腦血管疾病已成為當(dāng)今危害人類健康的重要疾病[1-2],其發(fā)病率、致殘率和死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳染病和癌癥,居各類疾病之首。其中缺血性心腦血管疾病具有致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多的臨床特點(diǎn)[2]。從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)和尋找防治缺血性心腦血管疾病的活性物質(zhì)對(duì)于解決這類健康問題意義重大。缺血性心腦血管疾病由血管於塞等引起,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致心腦組織缺血、缺氧而出現(xiàn)組織壞死等,其致死率逐年增高。血管網(wǎng)絡(luò)的重建是緩解缺血組織供氧的重要途徑,快速而有效地促進(jìn)組織血管新生,是缺血性心腦血管疾病治療和防治的新思路。黑蒜是一種新型的大蒜類保健食品,由普通大蒜在高溫、高濕環(huán)境下發(fā)生酶解和美拉德反應(yīng)后而成[3]。在保有大蒜原有營養(yǎng)成分和獨(dú)特保健功能的基礎(chǔ)上,黑蒜中新功能成分的產(chǎn)生,以及原有鮮大蒜中辛辣感和刺激性氣味的降低,使得黑蒜成為大家喜愛的藥食兼具型新興保健食品[4-6]。現(xiàn)有的文獻(xiàn)表明,黑蒜在抗氧化[7-9]、血脂調(diào)節(jié)[10-11]等方面具有一定的生物活性。然而,黑蒜對(duì)于心血管系統(tǒng)疾病的防治作用還缺乏全面的科學(xué)證據(jù)。

作為重要的新型模式生物,脊椎動(dòng)物斑馬魚具有體表透明可視、適合高通量、發(fā)育時(shí)間短、實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)用藥少、實(shí)驗(yàn)成本低、體表通透性好、具有脊椎動(dòng)物大部分組織和器官、與人類基因組同源性高、基因組全系列測(cè)序已完成以及多品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚日趨成熟等諸多特點(diǎn)[12-14],斑馬魚已成為構(gòu)建疾病模型、新藥研發(fā)和藥物篩選領(lǐng)域極富利用價(jià)值的活體生物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚15-18]。鑒于斑馬魚與人類具有極為相似的早期心血管發(fā)育系統(tǒng)[19],以及可用于造血系統(tǒng)生理和病理功能研究的熒光蛋白標(biāo)記血管的斑馬魚模型的構(gòu)建,為促/抗血管生成藥物的篩選提供了有利條件。以flk-1:GFP系轉(zhuǎn)基因魚為代表的斑馬魚模型,是采用綠色熒光蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮生長因子二型受體,借助熒光顯微鏡,人們能夠更加直觀、清楚地觀察到活體斑馬魚胚胎血管發(fā)育全程,適用于考察外源性藥物對(duì)斑馬魚血管生成的促進(jìn)或抑制作用,從而對(duì)符合要求的促/抗血管生成藥物進(jìn)行篩選。此外,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為血管內(nèi)壁與血液間的單層細(xì)胞,在維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定中,發(fā)揮重要的生理作用。內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)簡(jiǎn)單、有效,加之人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源于人體,是體外研究心血管系統(tǒng)的重要資源,這使得內(nèi)皮細(xì)胞成為心腦血管疾病研究的良好模型。

本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚血管生成檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn),從體內(nèi)和體外兩方面考察黑蒜對(duì)于血管新生的促進(jìn)作用,旨在為黑蒜價(jià)值的深入開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑蒜 萊蕪裕源食品有限公司(批號(hào)20170603);綠色熒光蛋白標(biāo)記血管的flk-1:GFP斑馬魚 山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái);人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 齊氏生物科技公司;DMEM/F12培養(yǎng)基 Hyclone公司;新鮮胎牛血清、0.25%胰酶 Gibco公司;青鏈霉素 上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;酪氨酸激酶抑制劑PTK787[20](又名瓦他拉尼,Vatalanib)、麻醉劑三卡因(tricaine,間氨基苯甲酸乙酯) Sigma Aldrich公司;丹紅注射液 山東丹紅制藥有限公司;鏈霉蛋白酶Pronase(斑馬魚胚胎脫膜劑) Solarbio公司;細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8) Dojindo公司。

SZX16熒光顯微鏡、DP2-BSW圖像采集系統(tǒng) 日本Olympus公司;斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備 北京愛生科技公司;博訊SPX-300B-G型光照培養(yǎng)箱 上?；巧锟萍加邢薰?。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑蒜提取液的制備 取40 g黑蒜,粉碎后加100 mL蒸餾水,80 ℃條件下提取4 h,過濾,得黑蒜提取液,4 ℃條件下避光保存,備用。

1.2.2 斑馬魚胚胎的制備與藥物處理 雌雄斑馬魚成魚在照明14 h/黑暗10 h恒溫(28 ℃)條件下分開飼養(yǎng)。取性成熟斑馬魚進(jìn)行交配并獲取胚胎,對(duì)受精卵進(jìn)行消毒和清洗后,加入到斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水(5 mmol/L NaCl,0.17 mmol/L KCl,0.4 mmol/L CaCl2,0.16 mmol/L MgSO4)中,置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待用。

取24 hpf(hours post-fertilization,受精后小時(shí))的斑馬魚胚胎進(jìn)行脫膜(幼魚孵化前的胚胎膜)處理,隨機(jī)分組并移入24孔板中,設(shè)空白對(duì)照組、血管模型組(添加0.2 μg/mL PTK787)、陽性對(duì)照組(添加30 μL/mL丹紅注射液,同時(shí)添加0.2 μg/mL PTK787)和黑蒜提取液處理組(設(shè)有0.2、0.8和3.2 μL/mL的濃度梯度,同時(shí)添加0.2 μg/mL PTK787)。每隔24 h換液一次,在28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并分別于48 hpf時(shí)通過熒光顯微鏡觀察斑馬魚節(jié)間血管(intersegmental vessel,ISV),72 hpf時(shí)觀察斑馬魚腸下靜脈(subintestinalis vessel,SIV)生長情況,通過DP2-BSW圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源于正常人臍靜脈血管內(nèi)膜表面,體外培養(yǎng)并接種于含DMEM/F12完全培養(yǎng)基的96孔板中,保證細(xì)胞數(shù)目約為6000個(gè)/孔,并于含有5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫度下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,分別加入受試藥物,詳細(xì)信息如下:空白對(duì)照組(不額外施加任何藥物)、陽性對(duì)照組(4.0 μL/mL丹紅注射液)和黑蒜提取液處理組(設(shè)有0.2、1.0和5.0 μL/mL的濃度梯度)。待內(nèi)皮細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的60%～80%時(shí),各組同時(shí)施加CCK-8溶液,將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,利用分光光度計(jì)檢測(cè)450 nm處細(xì)胞溶液的吸光度值,并以吸光度值的大小代表細(xì)胞活性的強(qiáng)弱。

1.2.4 鏡檢 在熒光顯微鏡(SZX16,Olympus)下利用FV10軟件對(duì)綠色熒光蛋白標(biāo)記血管的flk-1:GFP系斑馬魚ISV、SIV進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,在顯微鏡明場(chǎng)下對(duì)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,上述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于電腦中。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Adobe Photoshop CS3進(jìn)行圖片尺寸等處理,使用OriginPro 8.0(OriginLab Corp.,Northampton,MA,USA)和Microsoft Excel(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖像制作。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)的形式表示,其中,斑馬魚實(shí)驗(yàn)中,各組重復(fù)數(shù)n=8;細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中,各組重復(fù)數(shù)n=4。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用T-Test檢驗(yàn)和One-way-ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜提取液對(duì)斑馬魚ISV和SIV新生的促進(jìn)作用

2.1.1 黑蒜提取液對(duì)斑馬魚ISV新生的促進(jìn)作用 經(jīng)PTK787、丹紅注射液和不同濃度的黑蒜提取液處理的斑馬魚胚胎,通過熒光顯微鏡觀察到的flk-1:GFP系轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚胚胎ISV的生成情況如圖1所示,空白對(duì)照組中ISV從腹側(cè)背主動(dòng)脈(dorsal aorta,DA)或者后主靜脈(posterior cardinal vein,PCV)發(fā)出,向背側(cè)延伸到達(dá)背側(cè)縱向血管(dorsal longitudinal anastomotic vessels,DLAV),相鄰ISV間均勻而有序的并排分布,且在拐角處生成側(cè)枝。血管模型組中,PTK787的加入使得部分ISV僅僅長出血管芽或者ISV長度偏短,未與DLAV相連,且呈現(xiàn)出血管排列不規(guī)律、走向紊亂等特點(diǎn)。

圖1 各組藥物處理后斑馬魚ISV生長情況Fig.1 Angiogenesis of ISVs in zebrafish after drugs treatment注:A～F為各組斑馬魚胚胎ISV典型圖,如箭頭所示,其中A為空白對(duì)照組,B為血管模型組,C為陽性對(duì)照組,D～F為黑蒜提取液處理組(0.2 μL/mL(圖D)、0.8 μL/mL(圖E)、3.2 μL/mL(圖F))。

如圖2統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,PTK787處理斑馬魚24 h后,血管模型組斑馬魚ISV條數(shù)顯著(p<0.05)低于空白對(duì)照組,這提示PTK787對(duì)斑馬魚ISV的發(fā)育具有明顯的抑制作用。丹紅注射液及黑蒜提取液的加入,能很好地改善由PTK787引起的上述血管發(fā)育不全,并且黑蒜提取液的促血管生成作用呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性,帶有熒光信號(hào)的ISV條數(shù)隨著黑蒜提取液濃度升高而增加,當(dāng)黑蒜提取液濃度增加至3.2 μL/mL時(shí),PTK787對(duì)ISV熒光信號(hào)的抑制作用幾乎消失,提示黑蒜對(duì)斑馬魚胚胎ISV的生長起到明顯的促進(jìn)作用。

圖2 各組藥物處理后斑馬魚ISV生長情況的統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of angiogenesis of ISVs in zebrafish after drugs treatment注:各組斑馬魚胚胎ISV條數(shù)統(tǒng)計(jì)圖;*p<0.05對(duì)應(yīng)于空白對(duì)照組與血管模型組,#p<0.05對(duì)應(yīng)于給藥組(陽性對(duì)照組或者黑蒜提取液處理組)與血管模型組。

2.1.2 黑蒜提取液對(duì)斑馬魚SIV新生的促進(jìn)作用 經(jīng)血管生成抑制劑PTK787、丹紅注射液和不同濃度的黑蒜提取液處理的斑馬魚胚胎,由熒光顯微鏡觀察并分析flk-1:GFP系轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚胚胎SIV的生成情況如圖3所示。72 hpf時(shí),空白對(duì)照組典型SIV呈整齊的柵欄狀,連續(xù)無分枝。血管模型組斑馬魚SIV產(chǎn)生畸形,帶有熒光的血管幾乎完全消失。

圖3 各組藥物處理后斑馬魚SIV生長情況Fig.3 Angiogenesis of SIVs in zebrafish after drugs treatment注:A～F為各組斑馬魚胚胎SIV典型圖,如箭頭所示,其中A為空白對(duì)照組,B為血管模型組,C為陽性對(duì)照組,D～F為黑蒜提取液處理組(0.2 μL/mL(圖D)、0.8 μL/mL(圖E)、3.2 μL/mL(圖F))。

如圖4統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,PTK787處理斑馬魚48 h后,該血管模型組斑馬魚SIV條數(shù)顯著低于空白對(duì)照組(p<0.05),這提示PTK787對(duì)斑馬魚SIV的發(fā)育有著明顯的抑制作用。而經(jīng)丹紅注射液和不同濃度黑蒜提取液的額外處理后,帶有熒光信號(hào)的斑馬魚SIV的生長呈現(xiàn)出較好的恢復(fù)狀態(tài),并且黑蒜提取液的促SIV生成作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性,SIV條數(shù)隨著黑蒜提取液濃度升高而增加,當(dāng)黑蒜提取液濃度增加至3.2 μL/mL時(shí),PTK787對(duì)SIV的生成抑制作用幾乎消失,這提示黑蒜可促進(jìn)斑馬魚SIV的再生,也說明黑蒜提取液的促心血管生成作用廣泛存在于斑馬魚心血管系統(tǒng)。

圖4 各組藥物處理后斑馬魚SIV生長情況的統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of angiogenesis of SIVs in zebrafish after drugs treatment注:各組斑馬魚胚胎SIV條數(shù)統(tǒng)計(jì)圖,*p<0.05對(duì)應(yīng)于空白對(duì)照組與血管模型組,#p<0.05對(duì)應(yīng)于給藥組(陽性對(duì)照組或者黑蒜提取液處理組)與血管模型組。

2.2 黑蒜提取液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

內(nèi)皮細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)如圖5所示,內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長,胞體為扁平多角形或梭形,呈鋪路石狀相互嵌合,邊界清晰。

圖5 黑蒜提取液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of black garlic extract on proliferation of HUVECs 注:A-E分別為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的典型生長圖,A為空白對(duì)照組,B為陽性對(duì)照組,C-E為黑蒜提取液處理組(0.2 μL/mL(圖C)、1.0 μL/mL(圖D)、5.0 μL/mL(圖E))。

如圖6所示,相較于空白對(duì)照組,陽性對(duì)照組中丹紅注射液可顯著促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(p<0.05),增加內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目及其活性。較低濃度的黑蒜提取液(0.2 μL/mL)作用下,內(nèi)皮細(xì)胞活性稍有下降,但與空白對(duì)照組無顯著性差異(p>0.05);中濃度的黑蒜提取液(1.0 μL/mL)作用下,內(nèi)皮細(xì)胞活性有增強(qiáng)趨勢(shì),但與空白對(duì)照組仍無顯著性差異(p>0.05);高濃度的黑蒜提取液(5.0 μL/mL)作用下,內(nèi)皮細(xì)胞活性顯著高于空白對(duì)照組(其吸光度呈現(xiàn)出明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p<0.05)。且隨著黑蒜提取液使用濃度的提高,內(nèi)皮細(xì)胞密度變大,活性增強(qiáng),呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性,這提示黑蒜對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長起到一定的促進(jìn)作用。

圖6 黑蒜提取液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的統(tǒng)計(jì)Fig.6 Statistics of proliferation of HUVECs by black garlic extract注:經(jīng)CCK-8試劑盒處理后測(cè)得的各組細(xì)胞溶液的吸光度統(tǒng)計(jì)圖。*p<0.05對(duì)應(yīng)于陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組,#p<0.05對(duì)應(yīng)于黑蒜提取液處理組與空白對(duì)照組。

3 討論與結(jié)論

已有的研究顯示,黑蒜提取液可能通過減輕大鼠中性粒細(xì)胞浸潤、抑制脂質(zhì)過氧化等機(jī)制,進(jìn)而增加心肌缺血再灌注的保護(hù)作用[21];而Cheol等[22]研究發(fā)現(xiàn)黑蒜己烷提取物能顯著降低白血病細(xì)胞U937的細(xì)胞增殖,促進(jìn)心血管系統(tǒng)的發(fā)揮正常的生理作用。大蒜類食品對(duì)心腦血管疾病等有較好的防治功能[23]已是學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可的觀點(diǎn),而黑蒜在替代大蒜作為藥食兼用的保健品中所擁有的多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)[3-6],使得研究黑蒜的心血管保護(hù)作用變得愈發(fā)重要。本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)黑蒜的促進(jìn)血管生成作用進(jìn)行研究,根據(jù)熒光標(biāo)記的flk-1:GFP系轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管生成實(shí)驗(yàn),PTK787可以顯著減少ISV的數(shù)目(p<0.05),導(dǎo)致ISV發(fā)育畸形,而黑蒜提取液可顯著改善該模型中ISV發(fā)育畸形的問題,且?guī)в袩晒庑盘?hào)的ISV條數(shù)隨著黑蒜提取液濃度升高而增加,表明黑蒜提取液的促血管再生作用呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性。同樣,黑蒜提取液在促進(jìn)SIV的生成中呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性,這表明黑蒜的促心血管生成作用廣泛存在于斑馬魚心血管系統(tǒng)。另一方面,體外實(shí)驗(yàn)中,利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞研究黑蒜提取液的促血管生成作用,黑蒜提取液可顯著增加細(xì)胞密度(p<0.05),增強(qiáng)細(xì)胞活性,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性,這提示黑蒜或許同樣促進(jìn)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物血管的生成作用,再次為黑蒜促進(jìn)血管生成提供了科學(xué)依據(jù)。而以血管內(nèi)皮生長因子Ⅱ型受體Flk-1標(biāo)記血管的flk-1:GFP系轉(zhuǎn)基因斑馬魚則提示黑蒜促進(jìn)血管新生的機(jī)制可能與血管內(nèi)皮生長因子及其受體有關(guān)。鑒于此,黑蒜作為新興產(chǎn)品,有待開發(fā)成為一類防治心血管系統(tǒng)疾病的藥食兼?zhèn)涞谋＝∑贰?/p>