五味子酸性多糖分級(jí)產(chǎn)物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的改善作用

潘 炎,陶 雪,梁 爽,苑榮爽,李 賀,孫靖輝,陳建光,王春梅

(北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,吉林吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis)為木蘭科植物,其干燥成熟的果實(shí)是著名滋補(bǔ)性中藥,具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效。我國(guó)五味子南北均有分布,即南五味子(華中五味子)和北五味子(五味子)[1-4]。其中北五味子色黑,有效成分含量豐富,是長(zhǎng)白山道地藥材。五味子作為我國(guó)傳統(tǒng)保肝藥物,臨床常用于復(fù)方護(hù)肝制劑中,但有關(guān)五味子保肝作用的物質(zhì)基礎(chǔ)一直沒有明確定論[5-8]。

五味子的主要活性成分有木脂素類、多糖及揮發(fā)油等。其中多糖成分大約占五味子的10%左右[9-11]。近年的研究表明五味子多糖具有抗氧化、鎮(zhèn)咳、護(hù)肝、抗炎等多種功效,且安全性較好,日益受到業(yè)界的關(guān)注[12-15]。然而由于多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,多數(shù)研究都以五味子粗多糖為研究對(duì)象,課題組的研究也表明五味子粗多糖對(duì)CCl4、高脂飲食等誘導(dǎo)的肝損傷具有良好的保護(hù)作用[16-17],然而有關(guān)其進(jìn)一步的分級(jí)產(chǎn)物是否具有護(hù)肝作用尚未見報(bào)道。

本研究采用現(xiàn)代工藝分離純化五味子酸性多糖分級(jí)產(chǎn)物,建立小鼠急性酒精性肝損傷模型,觀察五味子酸性多糖分級(jí)產(chǎn)物對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用,為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子 吉林省集安五味子種植基地;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 北京化學(xué)試劑公司;苯酚 天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司;濃硫酸、乙醇 北京化工廠;間羥基聯(lián)苯、氨基磺酸 Sigma;雄性ICR小鼠 50只,體重19～21 g,由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物檢測(cè)合格證號(hào):SCXK(吉)2016-0003;超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試試劑盒、甘油三酯(TG)測(cè)試試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)試試劑盒、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)試試劑盒 南京建成生物工程公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;DEAE-纖維素 上海恒信化學(xué)試劑有限公司。

Infinite M200TECAN型酶標(biāo)儀 瑞士TECAN集團(tuán)公司;S10型手提式高速分散器 寧波新生生物科技股份有限公司;5418R型小型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;721B型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠;DP71型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司;Thermo ODS HYPERSIL高效液相色譜柱 日本島津;Shimadzu HPLC系統(tǒng) 日本Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五味子酸性多糖的提取、分離與純化 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定五味子多糖的最佳提取工藝條件,具體為五味子果實(shí)1.0 kg加入10倍蒸餾水浸泡24 h,經(jīng)100 ℃熱水煮提2次(3 h+2 h),將提取液經(jīng)80 ℃濃縮至2 L,離心(4500 r/min,15 min),棄去沉淀。向上清液加入95%乙醇,乙醇終濃度為75%(用酒精計(jì)測(cè)定),沉淀24 h,離心(4500 r/min,15 min),收集沉淀。將沉淀依次用95%乙醇和無水乙醇洗滌,水浴蒸干,得粉末狀五味子多糖85.5 g,得率為8.55%(多糖得率(%)=多糖質(zhì)量/五味子樣品質(zhì)量×100)。制備0.5%的多糖水溶液,上平衡好的DEAE-纖維素離子交換層析柱(20 mL,Cl-型),首先用蒸餾水洗脫,去除中性多糖,再用0.1、0.2、0.3和0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫,流速1 mL/min,分別收集洗脫液,加熱濃縮后干燥(80 ℃),得五味子酸性多糖,得率約為2.8%。取5 mg五味子酸性糖,溶于1 mL蒸餾水中,再次用0.1、0.2、0.3和0.5 mol/L NaCl水溶液進(jìn)行線性梯度洗脫,分別收集洗脫液,通過離子交換柱層析,可制備出五味子酸性糖分級(jí)產(chǎn)物。酸性糖分級(jí)產(chǎn)物得率(%)=分級(jí)產(chǎn)物質(zhì)量/五味子酸性多糖樣品質(zhì)量×100。

1.2.2 五味子酸性多糖的化學(xué)組成分析 采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[18],間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量[19],考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[20],采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化[21]和高效液相色譜法(洗脫流速為1.0 mL/min,色譜柱為Thermo ODS HYPERSIL色譜柱4.6 mm×150 mm,洗脫液為81.8%的PBS溶液0.1 mol/L,pH7.0和18.2%的乙腈v/v,檢測(cè)溫度為35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm)分析五味子多糖各級(jí)分的單糖組成。

1.2.3 酒精誘導(dǎo)急性肝損傷動(dòng)物模型的建立及處理 將50只小鼠按體重隨機(jī)分組,分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、SCAP-2各劑量組(5、10、20 mg/kg·bw)每組10只。常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。SCAP-2各劑量組給予SCAP-2進(jìn)行灌胃,正常對(duì)照組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃,每日一次,連續(xù)15 d。末次給藥1 h后,模型組及SCAP-2各劑量組小鼠給予灌胃50%乙醇(12 mL/kg·bw),正常對(duì)照組小鼠給予同體積生理鹽水灌胃,禁食不禁水。16 h后,各組小鼠摘取眼球取血,3500 r/min,4 ℃離心,分離血清,裝入1.5 mL離心管內(nèi),-80 ℃凍存。斷髓處死小鼠,迅速剖腹取出肝臟于冷的生理鹽水中,濾紙吸干。觀察整體形態(tài)以及表面光澤,取每只小鼠相同部位的肝小葉組織,分為兩份,一份置于10%中性福爾馬林溶液中固定待用,一份制備勻漿以用于肝組織相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4 ALT和AST水平的檢測(cè) 采用酶法測(cè)定血清中AST和ALT水平,具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.5 MDA、TG含量和SOD活性的檢測(cè) 剪取一定量的肝組織加入9倍量的生理鹽水,在冰水浴中用勻漿機(jī)制成組織勻漿,2500 r/min離心15 min,取上清液,-80 ℃凍存。分別采用TBA法和WST-1法測(cè)定肝組織和血清中MDA含量及SOD活性,采用GPO-PAP酶法測(cè)定肝組織中TG含量,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.6 病理學(xué)檢查 剪下肝左葉置于10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋切片常規(guī) HE 染色。在光鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子酸性多糖的化學(xué)組成分析

經(jīng)過離子交換柱層析進(jìn)行洗脫分級(jí)制備得到五味子酸性糖SCAP-1、SCAP-2、SCAP-3和SCAP-4。如表1所示,五味子酸性多糖SCAP-2的得率和糖醛酸含量最高,所以后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選用SCAP-2級(jí)分。

表1 五味子酸性多糖的化學(xué)組成分析Table 1 Analysis of chemical composition of Schisandra chinensis acidic polysaccharides

2.2 SCAP-2對(duì)小鼠血清中ALT和AST水平的影響

AST和ALT是肝細(xì)胞內(nèi)的主要功能酶,是肝細(xì)胞損害的敏感性指標(biāo),故小鼠血中AST和ALT水平的高低可判斷其肝細(xì)胞損傷的程度[22]。由表2可知,與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠血清AST和ALT水平均極顯著增高(p<0.01),說明小鼠一次性灌胃50%乙醇可引起肝細(xì)胞損傷;與模型組相比,不同劑量的SCAP-2可使小鼠血清中ALT和AST水平均有所下降,其中低劑量的SCAP-2對(duì)小鼠血清中ALT和AST水平的下降作用不顯著,中劑量的SCAP-2可顯著降低小鼠血清中的ALT水平(p<0.05),但對(duì)AST水平的降低效果不顯著,而高劑量的SCAP-2可顯著降低小鼠血清中的ALT和AST水平(p<0.05)。由此可知,適當(dāng)劑量的SCAP-2對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

表2 SCAP-2對(duì)小鼠血清中ALT和AST水平的影響(n=10)Table 2 Effects of SCAP-2 on ALT and AST levels in the serum of mice(n=10)

2.3 SCAP-2對(duì)小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響

酒精引起肝損傷的主要機(jī)制為氧化應(yīng)激損傷。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物,可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死,其含量可以反映過氧化損傷和細(xì)胞受損的程度。而SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,能有效清除代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基,減輕氧化應(yīng)激損傷,測(cè)定其活性可間接反映機(jī)體的抗氧化能力[23]。由表3可知,與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中SOD活性顯著降低(p<0.05)、MDA含量顯著升高(p<0.05),表明酒精致肝損傷小鼠機(jī)體抗氧化能力降低,氧化應(yīng)激增強(qiáng);與模型組比較,除SCAP-2低劑量組外,SCAP-2的其他兩個(gè)劑量組均可顯著升高SOD含量(p<0.05),顯著降低MDA含量(p<0.05),其中,SCAP-2高劑量組對(duì)小鼠血清SOD水平的升高作用極顯著(p<0.01)。由此表明,SCAP-2可能通過提高機(jī)體抗氧化能力改善酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。

表3 SCAP-2對(duì)小鼠血清中MDA含量和SOD活性的影響(n=10)Table 3 Effects of SCAP-2 on MDA content and SOD activity in the serum of mice(n=10)

2.4 SCAP-2對(duì)小鼠肝組織中MDA、TG含量和SOD活性的影響

大量攝入酒精,不僅可以引起肝臟氧化應(yīng)激損傷,還可以使三羧酸循環(huán)和脂肪酸氧化受阻從而影響脂肪代謝,致使甘油三酯(TG)在肝細(xì)胞內(nèi)沉積,大量蓄積可能導(dǎo)致病變[24]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了肝組織中MDA和TG含量和SOD活性。由表4可知,與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠肝組織中MDA和TG含量顯著增高(p<0.05或p<0.01),SOD活性顯著降低(p<0.05),提示模型建立成功;與模型組比較,SCAP-2低、中劑量組可顯著升高小鼠肝組織的SOD水平(p<0.05或p<0.01),但對(duì)小鼠肝組織中MDA和TG含量影響不顯著;SCAP-2高劑量組可極顯著升高小鼠肝組織的SOD水平(p<0.01),降低TG含量(p<0.01),顯著降低小鼠肝組織中MDA含量(p<0.05)。由此可知,適量劑量的SCAP-2可以使小鼠肝臟的氧化應(yīng)激狀況和脂肪代謝得以改善。

表4 SCAP-2對(duì)小鼠肝組織中MDA、TG含量和SOD活性的影響(n=10)Table 4 Effects of SCAP-2 on MDA and TG contents and SOD activity in the liver tissue of mice(n=10)

2.5 SCAP-2對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

由圖1可知,正常對(duì)照組小鼠的肝細(xì)胞排列整齊,大小正常,細(xì)胞核大而圓,核質(zhì)均勻分布,無水腫、變性、壞死、無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。模型組小鼠肝組織中肝索排列不規(guī)則,整個(gè)肝細(xì)胞胞漿疏松化,表明小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功。SCAP-2各劑量組小鼠肝細(xì)胞排列整齊,整個(gè)肝細(xì)胞胞漿疏松化明顯減輕,且以高劑量組明顯,表明SCAP-2可以改善酒精誘導(dǎo)的小鼠肝臟病理學(xué)變化。

3 討論與結(jié)論

多糖是五味子的主要活性成分之一,與木脂素類成分相比,具有含量高、毒性低等優(yōu)點(diǎn),極具開發(fā)價(jià)值。本研究采用柱層析法,經(jīng)過離子交換柱層析進(jìn)行洗脫分級(jí)制備得到五味子酸性多糖SCAP-1、SCAP-2、SCAP-3和SCAP-4。進(jìn)一步,觀察了SCAP-2對(duì)酒精性肝損傷的影響,結(jié)果表明SCAP-2可降低酒精誘導(dǎo)肝損傷模型小鼠血清中AST和ALT水平,改善肝細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化,對(duì)急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

肝臟是機(jī)體乙醇代謝的主要場(chǎng)所,在乙醇脫氫酶作用下生成乙醛,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙酸,進(jìn)入體循環(huán)。乙醇的大量脫氫氧化導(dǎo)致三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝,使TG在肝細(xì)胞內(nèi)沉積,同時(shí)過量酒精攝入引起肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化,并產(chǎn)生大量的氧自由基(ROS),過量的ROS造成氧化應(yīng)激、最終促進(jìn)脂質(zhì)氧化過程。因此,氧化損傷是酒精誘導(dǎo)肝損傷的主要機(jī)制之一。研究報(bào)道五味子多糖不僅可以清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、超氧陰離子自由基、羥自由基等,而且可以降低四氯化碳(CCl4)中毒小鼠肝組織丙二醛含量,提高SOD活性和GSH含量,體內(nèi)體外均具有顯著的抗氧化作用[25-26]。本研究結(jié)果也顯示SCAP-2能夠降低小鼠血清和肝組織中MDA含量,增加SOD活性,提示SCAP-2對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。

綜上所述,五味子酸性多糖的分級(jí)產(chǎn)物SCAP-2能降低急性酒精性肝損傷小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平,改善肝臟病理學(xué)變化,對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用,且其作用機(jī)制可能與抗自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及改善肝臟脂質(zhì)代謝有關(guān),這些結(jié)果為五味子多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。