超高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定水果中3種萘衍生物

仲伶俐,李 曦,郭靈安,李華仙,雷欣宇,付成平,趙 珊

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心,四川成都 610066)

萘衍生物1-萘乙酰胺(NAD)、1-萘乙酸(NAA)和2-萘氧乙酸(2-NOA),屬生長(zhǎng)素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,在果樹上使用能加強(qiáng)植株的新陳代謝和光合作用,刺激生長(zhǎng),促進(jìn)坐果和增大果粒等[1]。我國(guó)規(guī)定蘋果、葡萄和荔枝中NAA最大殘留限量(MRL)分別為0.1、0.1、0.05 mg/kg[2],對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)有SN 0346氣相色譜法(GC法),檢測(cè)限0.02 mg/kg[3],SN/T 2228氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法,檢測(cè)限0.01 mg/kg,需要三甲基硅烷化重氮甲烷衍生化,操作較復(fù)雜[4]。日本規(guī)定NAA在水果、蔬菜等產(chǎn)品中的最大殘留限量為0.03～5.0 mg/kg,NAD在蘋果和梨中的限量為0.1 mg/kg[5]。歐盟規(guī)定NAD、NAA、2-NOA在漿果類水果中的最大殘留限量分別為0.05、0.05、0.01 mg/kg[6]。NAA相關(guān)的測(cè)定方法已較成熟,除了上述標(biāo)準(zhǔn)方法GC法和GC-MS法外,主要有熒光法[7]、液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[8-9]、液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-13]。而國(guó)內(nèi)外對(duì)NAD和2-NOA的測(cè)定研究較少,汪偉[14]建立了NAA和2-NOA的HPLC-UV測(cè)定法。X Esparza[15]等建立了HPLC-MS/MS分析蘋果中NAD、NAA和NOA的方法,并研究了施藥后蘋果樣品中NAD、NAA和NOA殘留情況及NAD和NAA的降解規(guī)律。HPLC-MS/MS靈敏度和選擇性高,但儀器昂貴。水果樣品基質(zhì)復(fù)雜,采用HPLC-UV測(cè)定萘衍生物選擇性不高,易干擾定性和定量分析。

目前我國(guó)沒有NAD和2-NOA的限量規(guī)定和相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn),還未見有文獻(xiàn)報(bào)道采用液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定NAD、NAA和2-NOA。QuEChERS法作為一種快速、簡(jiǎn)便的殘留提取凈化技術(shù),在農(nóng)藥多殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[16]。本文采用超高效液相色譜-熒光檢測(cè)(UPLC-FLD)法,結(jié)合QuEChERS法低成本、簡(jiǎn)便快速的前處理技術(shù),建立同時(shí)測(cè)定水果中NAD、NAA和2-NOA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NAD、NAA和2-NOA標(biāo)準(zhǔn)品 純度均>99.0%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;甲酸 色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;甲醇、乙腈、二氯甲烷 色譜純,美國(guó)sigma-aldrich公司;氯化鈉 分析純,西隴化工有限公司;NH2固相萃取小柱 500 mg/6 mL,美國(guó)Thermo公司;PSA填料、C18填料、無(wú)水硫酸鎂(MgSO4) 美國(guó)Agilent公司;實(shí)驗(yàn)用水 優(yōu)普超純水系統(tǒng)制備;草莓、蘋果、柑橘、葡萄、荔枝(去核、去殼，切塊后用料理機(jī)制備成勻漿狀的水果樣品) 市售。

Agilent 1290超高效液相色譜儀(配有熒光檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司;waters e2695高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司;LD5-2A高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;WH-3微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;DT-1002A電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；Braun Multiquick 3 K 600料理機(jī) 德國(guó)博朗公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取溶劑和提取方法的選擇 提?、?稱取10 g制備好的勻漿狀水果樣品于100 mL具塞離心管中,加入20.0 mL乙腈,渦旋2 min,加入約5 g氯化鈉,蓋上蓋子,劇烈振搖1 min,4000 r/min離心5 min,使乙腈和水相分層。取10 mL乙腈層于50 mL梨形瓶中,于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干,洗耳球吹干,用4 mL二氯甲烷-乙腈(9∶1,V/V)淋洗液(A.含0.2%甲酸;B.含0.5%甲酸;C.含1%甲酸)溶解殘?jiān)?待SPE凈化。

提?、?稱取10 g制備好的勻漿狀水果樣品于100 mL具塞離心管中,加入10.0 mL乙腈溶液(A.含1%甲酸;B.含2%甲酸),渦旋2 min,加入約5 g氯化鈉,蓋上蓋子,劇烈振搖1 min,4000 r/min離心5 min,使乙腈相和水相分層。待QuEChERS凈化。

1.2.1.2 凈化方法的選擇 SPE凈化:用5 mL二氯甲烷-乙腈(9∶1,V/V)淋洗液(A.含0.2%甲酸;B.含0.5%甲酸;C.含1%甲酸)淋洗液活化NH2固相萃取小柱,棄去流出液,活化完成后加入提?、俚玫降拇齼艋瘶右?用50 mL梨形瓶收集流出液,再用上述淋洗液洗滌NH2固相萃取小柱2次,每次3 mL,合并流出液,于30 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干,洗耳球吹干,用乙腈-水(1∶1,V/V)溶液2 mL溶解殘?jiān)?經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后,供超高效液相色譜測(cè)定。

QuEChERS凈化:準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的吸附劑(①50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;②25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4)于2 mL離心管中,移取1 mL提?、诘玫降纳蠈铀嵝砸译嫣崛∫河谠撾x心管中,將提取液與吸附劑(a. 1%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;b. 2%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;c. 1%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4;d. 2%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4)混勻,3000 r/min離心3 min,取0.5 mL上清液,加入0.5 mL水,混勻,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后,供超高效液相色譜測(cè)定。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 色譜柱的選擇 比較ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)和ACQUITY UPLC BEH phenyl(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)2種色譜柱對(duì)化合物色譜分離的影響。

1.2.2.2 流動(dòng)相的選擇 比較乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸2種流動(dòng)相對(duì)色譜峰形和保留值的影響。

1.2.2.3 其它儀器條件 洗脫條件:乙腈-0.1%甲酸(25∶75,V/V)等度洗脫;流速:0.5 mL/min;熒光檢測(cè)波長(zhǎng):Ex=280 nm,Em=330 nm;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:4 μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確稱取NAD、NAA、2-NOA標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,貯存于密閉的棕色玻璃瓶中。準(zhǔn)確移取NAD、NAA和2-NOA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各0.5 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并逐級(jí)稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),以濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 稱取樣品后加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品中,使得樣品中NAD、NAA和2-NOA的含量為0.01、0.1和1.0 mg/kg,混勻并靜置30 min,用1.2.1方法前處理,用1.2.2方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent 1290Ⅱ色譜工作軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,用Excel 2007繪制,色譜圖由數(shù)據(jù)繪圖工具OriginPro 8繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法的選擇

因草莓基質(zhì)更加復(fù)雜，對(duì)測(cè)定的干擾相對(duì)其它水果更大，因此選取草莓樣品進(jìn)行凈化方法的選擇和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。草莓樣品經(jīng)乙腈提取,鹽析分層后進(jìn)行凈化操作。由于3個(gè)化合物中NAA和2-NOA都有一定的酸性,實(shí)驗(yàn)首先選擇了具有陰離子交換作用力的NH2固相萃取小柱凈化樣品,當(dāng)樣液通過(guò)NH2小柱時(shí),酸性化合物因離子交換作用被吸附,然后用酸性淋洗液進(jìn)行洗脫,當(dāng)淋洗液為含0.2%～1%甲酸的二氯甲烷-乙腈(9∶1,V/V)溶液時(shí),NAD和NAA回收率能達(dá)到70%以上,但2-NOA回收率很低,增加洗脫溶劑的極性和洗脫體積,仍不能得到改善。后采用更加簡(jiǎn)便、快速的QuEChERS法進(jìn)行前處理。樣品經(jīng)酸性乙腈提取,鹽析分層,PSA、C18和無(wú)水硫酸鎂吸附劑對(duì)提取液進(jìn)行QuEChERS凈化后測(cè)定。通過(guò)比較不同提取溶劑和吸附劑用量組成條件(如1.2.1中所述)下目標(biāo)化合物的回收率,如圖1所示,結(jié)果表明當(dāng)吸附劑用量相同的條件下,提取溶劑中酸含量增加對(duì)2-NOA的回收率有明顯的提高,當(dāng)提取溶劑相同的條件下,減少吸附劑用量能夠提高回收率。原因可能是PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺丙基官能團(tuán),具有陰離子交換作用,在去除樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖等干擾物的同時(shí),對(duì)分子結(jié)構(gòu)中帶有羧基的化合物有一定的保留作用[17],當(dāng)化合物所在溶劑環(huán)境達(dá)到一定的酸性條件下,這類化合物才能從吸附劑釋放出來(lái)。最終確定以2%甲酸-乙腈為提取液,25 mg PSA、25 mg C18和150 mg MgSO4進(jìn)行QuEChERS法凈化,此條件下3個(gè)化合物均能獲得較好的回收率。

圖1 不同提取溶劑和吸附劑用量下的回收率Fig.1 The recoveries of different extraction solvents and adsorbent dosage注:a. 1%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;b. 2%甲酸-乙腈,50 mg PSA,50 mg C18,150 mg MgSO4;c. 1%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4;d. 2%甲酸-乙腈,25 mg PSA,25 mg C18,150 mg MgSO4。

2.2 儀器條件的選擇與優(yōu)化

用液相色譜二極管陣列檢測(cè)器掃描NAA得到其最大紫外吸收波長(zhǎng)(UV)為220 nm,此波長(zhǎng)選擇性低。用熒光檢測(cè)器對(duì)NAA進(jìn)行掃描,得到其最佳激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為280、340 nm,用相同濃度的萘乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在UV220 nm和Ex280 nm,Em340 nm下測(cè)定,比較萘乙酸在這兩個(gè)檢測(cè)器上的色譜峰響應(yīng),見圖2、圖3,結(jié)果表明萘乙酸在最大紫外吸收波長(zhǎng)UV220 nm測(cè)得的色譜峰信噪比較低,熒光檢測(cè)器的靈敏度明顯高于紫外檢測(cè)器。用熒光檢測(cè)器對(duì)NAD和2-NOA進(jìn)行掃描,這2個(gè)化合物的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)均在280 nm和330 nm附近,且NAA在發(fā)射波長(zhǎng)為330 nm和340 nm下的響應(yīng)差異很小,因此,綜合3個(gè)化合物的峰響應(yīng),本方法采用選擇性和靈敏度更高的熒光檢測(cè)器,在Ex280 nm,Em330 nm下測(cè)定NAD、NAA和2-NOA。

圖2 萘乙酸在UV220 nm的色譜圖Fig.2 Chromatogram of NAA on UV220 nm

圖3 萘乙酸在Ex280 nm,Em340 nm的色譜圖Fig.3 Chromatogram of NAA on Ex280 nm,Em340 nm

通過(guò)比較ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC BEH phenyl色譜柱在乙腈-水,乙腈-0.1%甲酸不同流動(dòng)相條件下對(duì)色譜分離的影響,發(fā)現(xiàn)乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)色譜峰較寬,峰形不對(duì)稱,而乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相能夠改善色譜峰形,對(duì)保留值并無(wú)影響。在相同的流動(dòng)相條件下phenyl色譜柱對(duì)NAA和2-NOA的保留沒有C18色譜柱強(qiáng),而對(duì)NAD的保留差異不大。為了實(shí)現(xiàn)更快速的分離,實(shí)驗(yàn)選擇phenyl色譜柱,以0.1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相等度洗脫,在0.5 mL/min的流速下3個(gè)化合物在6 min內(nèi)能得到很好的分離,色譜峰尖銳對(duì)稱(如圖4所示)。由于水果品種較多,選擇基質(zhì)干擾較其它水果更大的草莓樣品的圖譜作為代表,從草莓空白樣品和加標(biāo)樣品色譜圖(圖5、圖6)可以看出,該條件下NAD、NAA和2-NOA在樣品中基本無(wú)色譜干擾。

圖4 3種萘衍生物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.4 Chromatogram of 3 naphthalene-derived compounds

圖5 草莓空白樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of the blank strawberry sample

圖6 草莓加標(biāo)樣品色譜圖(0.01 mg/kg)Fig.6 Chromatogram of the spiked strawberry sample(0.01 mg/kg)

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

經(jīng)超高效液相色譜儀測(cè)定,3種化合物在0.005～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)>0.9999。通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),根據(jù)信噪比(S/N)≥3的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù),確定方法檢出限(LOD)為0.002～0.003 mg/kg,根據(jù)信噪比(S/N)≥10的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù),確定方法定量限(LOD)為0.006～0.01 mg/kg。3種萘衍生物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表1。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)Table 1 Regression equations,r,LODs and LOQs

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

對(duì)草莓、蘋果和柑橘等空白樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),添加水平為0.01、0.1和1.0 mg/kg,考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,3種萘衍生物在水果中的添加回收率為78.3%～95.3%,RSD為2.8%～9.5%,準(zhǔn)確度與精密度能滿足殘留檢測(cè)要求。

表2 添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs(n=6)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

用該方法分別對(duì)購(gòu)買的草莓、蘋果、柑橘、葡萄、荔枝5種水果共25個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果均未檢出有NAD、NAA和2-NOA殘留。

3 結(jié)論

采用QuEChERS法凈化,建立了超高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定水果中1-萘乙酰胺、1-萘乙酸和2-萘氧乙酸的分析方法。該法測(cè)定水果中3種萘衍生物NAD、NAA和2-NOA,檢出限可達(dá)0.002～0.003 mg/kg,比我國(guó)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)NAA的檢測(cè)方法GC法和GC-MS法檢出限更低。通過(guò)方法準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)得到加標(biāo)回收率為78.3%～95.3%,RSD為2.8%～9.5%,準(zhǔn)確度與精密度均符合殘留分析要求,前處理操作簡(jiǎn)單、快速,選擇性和靈敏度均優(yōu)于HPLC-UV法,易于推廣應(yīng)用。