QuEchERs高效液相色譜柱后衍生法測定茶葉中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

王曉亮,毛衛(wèi)中,汪新華,樓春蘭,吳 飛,陸君羚,周 璇

(開化縣檢驗(yàn)檢測研究院,浙江開化 324300)

茶葉是我國重要的出口經(jīng)濟(jì)作物之一。日本和歐盟是我國茶葉的兩大出口地,對(duì)于茶葉中的農(nóng)藥殘留有著嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[1-2],農(nóng)藥殘留業(yè)已成為我國茶葉出口的瓶頸。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe的簡稱)前處理方法是近年來國際上新發(fā)展起來的一種樣品前處理方法,具有快速、簡單、廉價(jià)、高效、可靠、安全的優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道QuEChERS方法的應(yīng)用,除被廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜等樣品中的農(nóng)殘檢測外[3-5],還被應(yīng)用于油脂類[6]、糧谷類[7]、土壤[8]、中藥材[9]、動(dòng)物源食品[10]等樣品中農(nóng)殘檢測。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一類高效、廣譜殺蟲劑,它是一類以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的農(nóng)藥[11],主要應(yīng)用在糧食、蔬菜和水果上。目前QuEChERS方法雖然應(yīng)用廣泛,但是應(yīng)用于茶葉中的氨基甲酸酯檢測結(jié)合高效液相色譜-柱后衍生熒光法還未見報(bào)道,本文著眼于此點(diǎn)開發(fā)了此方法,可以對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)者有一定借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉樣品 開化龍頂,2016年4月茶葉監(jiān)督抽檢樣品,一芽一葉,粉碎備用;涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威標(biāo)準(zhǔn)品 濃度100 μg/mL,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所;甲醇、乙腈 色譜純,TEDIA公司;乙酸、無水乙酸鈉 分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;無水硫酸鎂 分析純,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)粉末 艾杰爾科技公司;實(shí)驗(yàn)用水 超純水;柱后衍生試劑套裝 鄰苯二甲醛(OPA)稀釋溶液,貨號(hào)CB910、水解試劑,貨號(hào)CB310、鄰苯二甲醛(OPA),貨號(hào)0120、巰基乙醇,貨號(hào)3700-2000,美國Pickering公司。

Waters e2695高效液相色譜儀 配Waters 2475熒光檢測器和柱后衍生裝置,美國Waters公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HN200氮吹儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司;Vortex-BE1漩渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司;微孔濾膜(0.22 μm) 島津公司;UPT-I-20T超純水機(jī) 上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確吸取10種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度100 μg/mL)100 μL置于進(jìn)樣小瓶中,配制成10 μg/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用甲醇將10 μg/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成1.0 μg/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,然后根據(jù)需要用甲醇配制成適當(dāng)濃度。

1.2.2 柱后衍生試劑的配制 先傾倒5 mL鄰苯二甲醛(OPA)稀釋溶液于干凈小燒杯中用于溶解巰基乙醇,稱取100 mg OPA于干凈小燒杯中,傾倒10 mL色譜純甲醇溶解,待完全溶解后傾倒入OPA稀釋溶液中,稱取2 g巰基乙醇倒入裝有OPA稀釋溶液的小燒杯中,溶解完畢后傾倒入OPA稀釋溶液中。

1.2.3 樣品提取和凈化 精確稱取2.00 g茶葉粉末,加入10.0 mL 0.1%醋酸乙腈提取液,振蕩,超聲提取10 min加入1.0 g無水硫酸鎂,1.0 g無水乙酸鈉,渦旋振蕩30 s后,4000 r/min離心5 min,吸取5 mL上清液于15 mL已加入1.5 g無水硫酸鎂、150 mg PSA粉末的離心管中,輕搖振蕩,4000 r/min離心5 min,吸取1 mL上清液于15 mL離心管中,氮?dú)獯蹈?用1 mL乙腈水(1+1)復(fù)溶,過0.22 μm濾膜后供液相色譜分析。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.4.1 液相色譜條件 Waters公司氨基甲酸酯農(nóng)藥分析色譜柱(150 mm×3.9 mm,粒徑5 μm);柱溫42 ℃;進(jìn)樣體積10 μL。液相色譜洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相組成及梯度洗脫程序Table 1 The mobile phase and gradient eluted program

1.2.4.2 柱后反應(yīng)單元及試劑管理單元的設(shè)定 柱后反應(yīng)單元溫度:80 ℃;試劑管理單元流速:水解試劑:0.3 mL/min;鄰苯二甲醛/巰基乙醇溶液:0.3 mL/min。

1.2.4.3 Waters 2475熒光檢測器的設(shè)定 激發(fā)波長:339 nm,發(fā)射波長:445 nm,采集點(diǎn)數(shù):10點(diǎn)/s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用EXCEL 2010統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析,利用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取與凈化條件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化 茶葉中農(nóng)殘檢測樣品取樣量和蔬菜水果中的農(nóng)殘檢測樣品取樣量差別較大,因?yàn)椴枞~樣品本身含有的干擾物質(zhì)較多,較大取樣量會(huì)增大基質(zhì)中的干擾,相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過茶葉中農(nóng)殘檢測的取樣量為2 g或5 g[12-13],因此為了降低干擾,取樣量要適度降低,故本方法采用的取樣量為2 g。

在提取前是否加水浸泡及提取液的體積選擇方面,王翔等[14]詳細(xì)研究了加水浸泡對(duì)于干茶葉中農(nóng)殘?zhí)崛〉挠绊?發(fā)現(xiàn)加水浸泡反而降低了茶葉中農(nóng)殘的提取率。因此本實(shí)驗(yàn)提取前不加水。

對(duì)于提取液的體積選擇方面,查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,陳磊等[15]詳細(xì)研究了利用乙腈并采用不同料液比對(duì)于提取茶葉中氨基甲酸酯類農(nóng)殘的影響,結(jié)果表明料液比為1∶5時(shí)回收率最優(yōu)。陳磊等人所采用的提取過程與本文方法一致,同為提取前不加水浸泡并且提取溶劑也同為乙腈,所以本方法的乙腈提取液體積為10 mL。

無水硫酸鎂在提取過程中起到結(jié)合提取液中的水分的作用,考慮到茶葉為水分較少的樣品,1 g無水硫酸鎂結(jié)合水后為七水硫酸鎂,理論上能夠結(jié)合1.05 g水,所以2 g茶葉樣品中加入1 g無水硫酸鎂能夠除去多余水分。

2.1.2 N-丙基乙二胺(PSA)凈化填料的用量 實(shí)驗(yàn)證明,PSA凈化填料的加入能夠顯著除去茶葉中的脂肪酸、糖類和一些色素等干擾物質(zhì),使提取液得到有效凈化。PSA的加入能夠去除茶葉中的干擾物質(zhì),同時(shí)也會(huì)在一定程度上吸附目標(biāo)農(nóng)藥,降低回收率[16]。因此,在實(shí)驗(yàn)中需要綜合考慮凈化填料的使用量。分別實(shí)驗(yàn)了添加150、300、500 mg PSA凈化填料的農(nóng)藥回收率,結(jié)果顯示添加150 mg PSA和300 mg PSA的農(nóng)藥平均回收率分別為88.77%和86.34%,都符合GB/T 27404-2008中關(guān)于回收率在80%～110%之間的技術(shù)要求,而添加500 mg PSA的農(nóng)藥平均回收率為78.84%,并不符合相關(guān)要求?？紤]回收率和成本的因素,因此本實(shí)驗(yàn)選用150 mg PSA作為凈化填料的添加量。

2.2 相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

吸取十種氨基甲酸酯農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.0 μg/mL)適量,用甲醇稀釋成濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列,分別吸取10 μL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和凈化后的樣品溶液注入液相色譜儀中,以保留時(shí)間定性,以峰面積定量。其色譜圖分別見圖1和圖2。上述十種氨基甲酸酯農(nóng)藥在0.01～0.50 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性,相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.9996以上。結(jié)果見表2。

表2 10種氨基甲酸酯農(nóng)藥回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(R2),linear rangs,detection limits and quantization limits of 10 carbamates pesticide

圖1 10種氨基甲酸酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(500 ng/mL)Fig.1 Standard chromatography of 10 carbamate pesticides(500 ng/mL)

2.3 檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

在陰性茶葉樣品中分別添加涕滅威亞砜、涕滅威砜和滅多威0.02 mg/kg做檢出限測定,添加0.05 mg/kg做定量限測定;分別添加三羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威和仲丁威0.01 mg/kg做檢出限測定,又添加0.05 mg/kg做定量限測定,以S/N(信噪比)=3的濃度為檢出限,以S/N(信噪比)=10的濃度為定量限,結(jié)果見表2。

2.4 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

用十種氨基甲酸酯農(nóng)殘為陰性的茶葉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),對(duì)樣品進(jìn)行0.1、0.25、0.5 mg/kg三個(gè)水平的添加,每個(gè)水平平行測定6次,結(jié)果見表3,測得平均回收率為81.98%～95.59%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.22%～4.98%,說明該方法重現(xiàn)性好,精密度高,達(dá)到分析要求。

表3 10種氨基甲酸酯農(nóng)藥回收率(n=6)Table 3 Recoveries of 10 carbamate pesticides

3 結(jié)論

本文建立了Quechers前處理-高效液相色譜柱后衍生熒光法檢測茶葉中10中氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的方法。相對(duì)于傳統(tǒng)的氨基柱凈化方法,本方法簡便、高效,通過提取凈化條件的優(yōu)化,梯度洗脫分離,10種氨基甲酸酯農(nóng)藥在24 min內(nèi)能夠達(dá)到較好分離。方法學(xué)結(jié)果表明該方法的回收率高,重復(fù)性好,精密度高,適合于茶葉中的氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留分析測定。