常壓鼓風(fēng)干燥法制備直投式納豆菌劑工藝

嚴(yán)美婷,余 苗,陳衛(wèi)平,湯凱潔,李冬梅,熊詩(shī)青,杜 娟,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045;2.江西省糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,江西南昌 330046)

納豆菌是從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出來(lái)的對(duì)人體無(wú)害的安全菌株,常被作為納豆制品的生產(chǎn)菌種。納豆菌在納豆發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生許多對(duì)人體有益的生理活性物質(zhì),尤其是有溶栓功能的納豆激酶[1-2]。有研究表明,長(zhǎng)期食用納豆能有效預(yù)防和治療心腦血管疾病[3],因此在“三高”病人越來(lái)越多的今天,納豆及納豆制品廣受人們的追捧,同時(shí),對(duì)于用以生產(chǎn)納豆的菌種——納豆菌劑也成為了廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái),直投式納豆菌劑由于其具有發(fā)酵活力強(qiáng)、不易污染、易貯藏及使用方便等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛應(yīng)用[4]。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)直投式納豆菌劑的制備研究多局限于真空冷凍干燥技術(shù)和噴霧干燥技術(shù)[5],采用真空冷凍干燥法制備的納豆菌劑雖然活菌率較高,但操作復(fù)雜,效率低,設(shè)備投入大,成本高,不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[6];噴霧干燥法雖然生產(chǎn)量大,效率高,但由于干燥溫度太高,會(huì)導(dǎo)致菌活力和活菌率降低[7-8]。因此尋找操作簡(jiǎn)單、效率高、成本低的干燥方法是研究的重要方向。目前關(guān)于此法制備直投式納豆菌劑的研究,及對(duì)其干燥保護(hù)劑和載體基質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。本文采用常壓鼓風(fēng)干燥法制備直投式納豆菌劑,優(yōu)化得到其最佳工藝,并測(cè)定了菌劑的發(fā)酵性能和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性,以期研制出一種發(fā)酵性能好、活菌率高及生產(chǎn)成本低的直投式納豆菌劑,從而提高納豆及納豆制品的生產(chǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆菌(Bacillusnatto) 實(shí)驗(yàn)室保藏;成漱納豆菌劑 日本鈴與工業(yè)株式會(huì)社;生物力納豆菌 江蘇微康生物科技有限公司;黃豆、碎米粉 南昌沃爾瑪超市購(gòu)買(mǎi);脫脂乳粉 內(nèi)蒙古伊利有限公司;檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、福林酚 分析純;種子液培養(yǎng)基 葡萄糖1.0%,牛肉膏 0.5%,蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 0.5%,pH7.0;發(fā)酵液培養(yǎng)基 可溶性淀粉3.0%,酵母膏2%,K2HPO40.01%,KH2PO40.01%,CaCl20.05%,pH6.5。

T22型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;AR2140電子分析天平 奧豪斯有限公司;MJ-54A高壓滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備有限公司;HFsafe-1200LC型生物安全柜 上海力申科學(xué)儀器有限公司;DH3600電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;DHG-9101-2S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆菌的收集 將納豆菌菌種接種于種子液培養(yǎng)基中,以37 ℃、160 r/min的條件振蕩培養(yǎng)12 h,繼而將種子液以3%的接種量接種至發(fā)酵液培養(yǎng)基中,以相同的條件培養(yǎng)24 h,取培養(yǎng)好的菌液以6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心8 min[9],收集菌泥,備用。

1.2.2 直投式納豆菌劑的制備 將收集得到的納豆菌菌泥以適當(dāng)?shù)谋壤c保護(hù)劑溶液混合均勻制成菌懸液,靜置一段時(shí)間后與載體基質(zhì)以一定的比例攪拌均勻,置于鼓風(fēng)干燥箱中常壓低溫烘干,制成直投式納豆菌劑。

1.2.3 直投式納豆菌劑的制備工藝優(yōu)化

1.2.3.1 保護(hù)劑的優(yōu)化 根據(jù)單一保護(hù)劑的篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取脫脂乳粉、谷氨酸鈉及檸檬酸鈉作為納豆菌干燥復(fù)合保護(hù)劑,將菌泥以1∶7 (g/mL)的比例與pH為7.0的復(fù)合保護(hù)劑溶液混勻制成菌懸液,靜置30 min后與載體基質(zhì)碎米粉以1∶3 (mL/g)的比例混勻,裝入信封中置于40 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h制成直投式納豆菌劑。以存活率為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[10-12],得到納豆菌常壓鼓風(fēng)干燥復(fù)合保護(hù)劑配方,因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.3.2 納豆菌菌泥與保護(hù)劑混合條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取菌泥與復(fù)合保護(hù)劑混合比例(g/mL)、復(fù)合保護(hù)劑pH以及菌泥與復(fù)合保護(hù)劑的平衡時(shí)間進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[13]。將重懸于復(fù)合保護(hù)劑中的納豆菌菌懸液與載體基質(zhì)碎米粉以1∶3 (mL/g)的比例混勻后以40 ℃的溫度烘干12 h制成直投式納豆菌劑,以存活率為指標(biāo),得到最佳菌泥與保護(hù)劑混合條件。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 菌泥與保護(hù)劑混合條件正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of the mixing conditions of bacterial sludge and protective agent orthogonal experiments

1.2.3.3 納豆菌載體基質(zhì)的選擇 將重懸于復(fù)合保護(hù)劑中的納豆菌菌懸液與載體基質(zhì)以一定比例混勻后以40 ℃的溫度烘干12 h制成直投式納豆菌劑,考察不同的載體基質(zhì)(小麥粉、碎米粉、木薯淀粉)對(duì)干燥后菌劑的性狀、納豆菌的存活率及發(fā)酵性能的影響,以及考察不同的菌懸液與基質(zhì)混合比例(mL/g,1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)對(duì)納豆菌存活率的影響,以得到最佳的載體基質(zhì)及混合比例。

1.2.3.4 干燥條件的確定 本實(shí)驗(yàn)將干燥溫度設(shè)定為40、50、60 ℃,干燥時(shí)間設(shè)定為6、9、12 h,測(cè)定在不同的干燥溫度和時(shí)間下得到的菌劑的含水量及菌劑中納豆菌的存活率,從而選出最佳的干燥溫度及干燥時(shí)間。

1.2.4 發(fā)酵性能測(cè)定 為考察本實(shí)驗(yàn)制備的直投式納豆菌劑的發(fā)酵性能,將得到的菌劑及市售的兩種納豆菌劑接入大豆中進(jìn)行納豆發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[14],測(cè)定納豆中的納豆激酶酶活力,比較它們的發(fā)酵性能。

1.2.5 貯藏穩(wěn)定性測(cè)定 將制備好的直投式納豆菌劑用自封袋密封好,分別置于25、4、-20 ℃條件下儲(chǔ)藏,每隔10 d測(cè)一次,測(cè)定180 d內(nèi)納豆菌活菌數(shù)的變化情況及菌劑的發(fā)酵性能。

1.2.6 納豆菌劑含水量、納豆菌存活率及納豆激酶酶活力的測(cè)定 含水量測(cè)定采用直接干燥法(GB/T 5009.3-2010第一法);納豆菌存活率測(cè)定:干燥前總活菌數(shù)=每克濕菌劑活菌數(shù)×濕菌劑重量,干燥后總活菌數(shù)=每克干菌劑活菌數(shù)×干菌劑重量,納豆菌存活率=(干燥后總活菌數(shù)÷干燥前總活菌數(shù))×100%,其中菌劑中納豆菌活菌數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定;納豆激酶酶活力測(cè)定采用福林酚法[15-16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS v6.55軟件分析,響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-expert 8.05軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖用Excel 2003軟件和OriginPro 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 直投式納豆菌劑的制備工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 保護(hù)劑的優(yōu)化結(jié)果 對(duì)納豆菌進(jìn)行常壓干燥時(shí),納豆菌細(xì)胞中一些物質(zhì)易發(fā)生氧化,酶等活性物質(zhì)的活性會(huì)被破壞,細(xì)胞發(fā)生熱損傷[17]。選擇適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑,可有效地避免或減輕這一問(wèn)題[18]。常用保護(hù)劑有脫脂乳粉、谷氨酸鈉和檸檬酸鈉等[19-20],本實(shí)驗(yàn)選用此三種物質(zhì)作為納豆菌干燥復(fù)合保護(hù)劑,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)Design Expert 8.05對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,明確各因素對(duì)響應(yīng)值Y(存活率)的影響,得到回歸方程為:Y=74.48+5.66A+3.03B-0.43C+1.48AB-0.95AC+2.18BC-6.11A2-8.82B2-3.64C2。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experiment design and results of Box-Behnken response surface

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface methodology

由表4可知,模型的F值為35.65,p<0.0001,說(shuō)明該模型回歸極顯著,失擬項(xiàng)的p值為0.1014>0.05,失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明該模型適當(dāng),回歸方程擬合度良好,可以利用該回歸方程確定納豆菌干燥復(fù)合保護(hù)劑的最佳濃度。該回歸模型的調(diào)整系數(shù)為R2=0.9512,即該模型能解釋95.1%響應(yīng)值的變化,模型擬合度良好,實(shí)驗(yàn)誤差小,說(shuō)明可用此模型來(lái)預(yù)測(cè)納豆菌干燥保護(hù)劑的最佳配方。該方程的A、B因素對(duì)納豆菌的存活率影響極顯著,A2、B2、C2因素影響極顯著,BC的交互作用顯著,其他均不顯著。由對(duì)存活率回歸系數(shù)檢驗(yàn)值F可知,各因素對(duì)存活率影響主次順序?yàn)锳(脫脂乳粉)>B(谷氨酸鈉)>C(檸檬酸鈉)。根據(jù)響應(yīng)面回歸方程,BC因素之間的交互作用的模型響應(yīng)曲面見(jiàn)圖1。

圖1 谷氨酸鈉和檸檬酸鈉交互作用的響應(yīng)面圖Fig.1 The response surface of interaction of sodium glutamate and sodium citrate

由圖1可知,BC兩因素的交互作用對(duì)納豆菌存活率的影響較大,存活率隨著檸檬酸鈉和谷氨酸鈉濃度的升高,都出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),故在圓心處存在極值,且BC兩因素的交互作用p值<0.05,說(shuō)明BC的交互作用存在顯著差異。

根據(jù)模型預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑組合為11.07%脫脂乳粉、6.41%谷氨酸鈉、14.76%檸檬酸鈉,納豆菌存活率為76.18%。采用此保護(hù)劑組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果得出實(shí)際測(cè)得的菌劑中的納豆菌存活率為74.98%,與預(yù)測(cè)值76.18%僅相差1.58%,說(shuō)明該模型可靠性好。在相同條件下未加保護(hù)劑制得菌劑,測(cè)定其存活率僅為43.05%。結(jié)果表明,保護(hù)劑的加入可使納豆菌經(jīng)常壓干燥后菌活力大大提高。

2.1.2 納豆菌菌泥與保護(hù)劑混合條件的優(yōu)化結(jié)果 菌泥與保護(hù)劑的混合比例直接影響著菌體細(xì)胞的通透性,從而影響菌體的存活率[21]。陸愛(ài)華[13]研究發(fā)現(xiàn)將乳酸菌進(jìn)行冷凍干燥時(shí),保護(hù)劑的pH對(duì)干燥后存活率有顯著影響,pH太高或太低都會(huì)降低發(fā)酵劑的活菌率。李東華[22]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)卦黾泳嗯c保護(hù)劑的平衡時(shí)間,有利于保護(hù)劑滲入到菌體內(nèi),充分發(fā)揮保護(hù)劑的保護(hù)作用,提高菌體的抗高溫能力,從而提高存活率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化納豆菌菌泥與保護(hù)劑的混合條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5極差分析結(jié)果可知,RB>RA>RC,即各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響大小為B>A>C。因此得出保護(hù)劑的pH對(duì)納豆菌干燥后的存活率影響最大,其次為菌泥與保護(hù)劑的混合比例,菌泥與保護(hù)劑的平衡時(shí)間對(duì)納豆菌存活率的影響不明顯,通過(guò)均值結(jié)果可直觀分析得到最佳方案為A2B2C1。對(duì)此最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得出納豆菌劑的活菌率高達(dá)85.76%。因此納豆菌菌泥與保護(hù)劑的最適混合條件為:菌泥與復(fù)合保護(hù)劑混合比例(w/v)為1∶7、復(fù)合保護(hù)劑pH為6.0、菌泥與復(fù)合保護(hù)劑的平衡時(shí)間為35 min,此條件下納豆菌存活率為85.76%。

表5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiments

2.1.3 納豆菌載體基質(zhì)的選擇

2.1.3.1 載體基質(zhì)種類(lèi)的選擇 將重懸于復(fù)合保護(hù)劑中的納豆菌菌懸液直接進(jìn)行常壓鼓風(fēng)干燥時(shí)所需溫度高,耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)菌體的傷害較大,而將菌懸液先與載體物料混合后再進(jìn)行烘干恰好能克服以上不足,菌體的存活率較高[23]。本實(shí)驗(yàn)分別選取小麥粉、碎米粉和木薯淀粉作為納豆菌的載體基質(zhì),它們對(duì)干燥后菌劑的性狀、納豆菌的存活率以及固態(tài)發(fā)酵性能的影響結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同載體基質(zhì)對(duì)納豆菌劑制備的影響Table 6 The influence of different carrier substrates on the preparation of Bacillus natto starter culture

由表6可知,以木薯淀粉作為載體基質(zhì)時(shí),納豆菌存活率雖較高,但菌劑易結(jié)塊,復(fù)溶性差,固態(tài)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的納豆激酶酶活力相對(duì)不高。以小麥粉和碎米粉為載體基質(zhì),干燥后菌劑顆粒松散,復(fù)溶性都較好,但以碎米粉作為載體時(shí)納豆菌的存活率及納豆激酶酶活力都高于小麥粉,可能是由于菌劑的成分不同對(duì)菌劑的活性有一定的影響。且碎米粉為農(nóng)產(chǎn)品下腳料,價(jià)格低廉,因此綜合考慮選擇碎米粉作為直投式納豆菌劑的載體材料。

2.1.3.2 菌懸液與載體基質(zhì)混合比例的選擇 由圖2可知,隨著菌懸液與碎米粉混合比例的增大,納豆菌存活率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)混合比例為1∶2時(shí)納豆菌的存活率最高,達(dá)到86.93%,這說(shuō)明適量的碎米粉對(duì)納豆菌常壓烘干有一定的保護(hù)作用。經(jīng)測(cè)定菌懸液與碎米粉混合比例為1∶2時(shí)制成的菌劑中菌含量達(dá)到8.34×1010cfu/g,符合市售納豆菌劑中菌數(shù)應(yīng)達(dá)到1010～1012cfu/g的標(biāo)準(zhǔn)要求[24],故綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)效益,選擇1∶2 (mL/g)作為最佳的菌懸液與碎米粉混合比例。

圖2 菌懸液與碎米粉混合比例對(duì)納豆菌存活率的影響Fig.2 The effect of mixed ratio of bacterial suspension and rice flour on survival rate of Bacillus natto

2.1.4 干燥條件的確定 Kearney等[25]、Zhang等[26]報(bào)道了菌劑的水分含量對(duì)菌劑的發(fā)酵活性及貯藏穩(wěn)定性有一定的影響,在含水量低于5%時(shí)最有利于保持菌劑的活性。故實(shí)驗(yàn)考察了不同的干燥條件時(shí)納豆菌劑活菌率及含水量的影響。由表7可知，適當(dāng)?shù)亟档秃娓蓽囟燃皶r(shí)間可以明顯提高納豆菌的存活率，但同時(shí)，納豆菌劑的含水量也會(huì)增加。因此，綜合考慮，選擇50 ℃干燥9 h作為納豆菌常壓鼓風(fēng)干燥的時(shí)間及溫度。在此條件下制備的納豆菌劑活菌率達(dá)82.66%，含水量為4.767%，含菌量為7.93×1010cfu/g,高于鐘青萍等[27]用噴霧干燥法制備的含菌量為1×109cfu/g左右的納豆菌活菌制劑及胥振國(guó)等[28]用冷凍干燥法制備的含菌量為3.56×109cfu/g的凍干納豆菌粉。

表7 干燥條件對(duì)納豆菌存活率的影響Table 7 The effect of drying conditions on the survival rate of Bacillus natto

2.2 發(fā)酵性能測(cè)定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研制的直投式納豆菌劑及市售的兩種納豆菌劑的固態(tài)發(fā)酵性能測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不同發(fā)酵菌劑的發(fā)酵性能測(cè)定結(jié)果Table 8 The results of different fermentation agents’ fermentation performance

由表8可知,本實(shí)驗(yàn)研制的納豆菌劑的活菌數(shù)雖然比生物力納豆菌劑的活菌數(shù)低,但此菌劑中納豆菌的活性更強(qiáng),相比于其他兩種發(fā)酵菌劑,此菌劑固態(tài)發(fā)酵得到的納豆感官品質(zhì)最好,納豆激酶酶活力最高,因此本實(shí)驗(yàn)研制的直投式納豆菌劑市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)。

2.3 貯藏穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

貯藏穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)一種發(fā)酵菌劑品質(zhì)好壞的關(guān)鍵指標(biāo),而貯藏溫度是影響菌體存活的主要因素[29],由圖3可知,在25 ℃條件下貯藏時(shí),納豆菌劑的活菌數(shù)隨著時(shí)間的增加而明顯下降,發(fā)酵活力也明顯降低,因此該發(fā)酵菌劑不適合在25 ℃下貯藏。在4 ℃和-20 ℃貯藏180 d后,菌劑的活菌數(shù)及發(fā)酵活力都無(wú)明顯變化,發(fā)酵性能較穩(wěn)定,說(shuō)明此菌劑在4 ℃或-20 ℃條件下貯藏較穩(wěn)定。

圖3 納豆菌劑的貯藏穩(wěn)定性Fig.3 The storage stability of Bacillus natto starter culture

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化常壓鼓風(fēng)干燥法制備直投式納豆菌劑的工藝,得到最佳工藝為:復(fù)合干燥保護(hù)劑配方為11.07%脫脂乳粉、6.41%谷氨酸鈉和14.76%檸檬酸鈉;菌泥與保護(hù)劑的混合條件為:菌泥與復(fù)合保護(hù)劑混合比例(g/mL)1∶7、復(fù)合保護(hù)劑pH為6.0、平衡時(shí)間35 min;納豆菌的載體基質(zhì)為碎米粉,菌懸液與碎米粉的混合比例為1∶2 (mL/g);納豆菌劑的干燥條件為50 ℃干燥9 h。在此工藝下制備的納豆菌劑活菌率達(dá)82.66%,含菌量7.93×1010cfu/g,含水量4.767%,符合市售納豆菌發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)要求,經(jīng)測(cè)定表明此直投式納豆菌劑發(fā)酵性能好,低溫貯藏性質(zhì)穩(wěn)定。因此采用常用鼓風(fēng)干燥法制備直投式納豆菌劑,工藝簡(jiǎn)便、成本低,具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),可推廣至工業(yè)生產(chǎn)中。