D407A/D430A雙位點(diǎn)突變對(duì)嗜熱酸性生淀粉α淀粉酶GTamy酶學(xué)性質(zhì)的影響

曾 靜,郭建軍,袁 林

(江西省科學(xué)院微生物研究所,江西南昌 330096)

天然生淀粉是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜而致密的顆粒,在應(yīng)用前往往需要經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫或者酶法處理來(lái)破壞生淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)[1]。酶法降解生淀粉能夠簡(jiǎn)化現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中的生淀粉前處理過(guò)程,更加環(huán)保并節(jié)約能耗,因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度關(guān)注[2-3]。生淀粉酶是指能對(duì)不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉顆粒表現(xiàn)出強(qiáng)水解活性的酶類(lèi)[4]。多種微生物包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌和放線菌都能夠產(chǎn)生生淀粉酶。在α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶中均有部分酶具有水解生淀粉的能力[4]。

生淀粉α-淀粉酶可以在低于糊化溫度條件下直接作用于未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉顆粒,在淀粉液化過(guò)程中能夠省去生淀粉糊化步驟,有利于節(jié)約能源和簡(jiǎn)化工藝,因此生淀粉α-淀粉酶在食品、造紙、紡織等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[5-6]。在淀粉雙酶法水解工藝中為了防止雜菌污染需要適當(dāng)加溫,至少要達(dá)到60 ℃。此外,生淀粉加水形成的乳濁液的pH一般為5.8～6.5,由于淀粉工業(yè)中循環(huán)工藝的應(yīng)用,淀粉水解過(guò)程中的pH通常在5.0左右[7-10]。因此,獲得耐高溫、低pH和不依賴于Ca2+的生淀粉α-淀粉酶,有利于對(duì)現(xiàn)行淀粉加工工業(yè)的工藝體系進(jìn)行技術(shù)升級(jí)和改造。

來(lái)源于嗜熱菌Geobacillusthermoleovorans的α-淀粉酶GTamy屬于嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶,具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性,其最適反應(yīng)溫度為80 ℃,最適反應(yīng)pH為5.0,于80 ℃的可溶性淀粉酶活達(dá)1723 U/mg,于80 ℃的半衰期為184 min,其活性和熱穩(wěn)定性均不依賴于Ca2+[11]。GTamy是目前報(bào)道的玉米淀粉降解率最高的生淀粉α-淀粉酶,使用0.1 U/(mg淀粉)的酶液,于80 ℃水解30%玉米淀粉3 h(pH5.0),玉米淀粉降解率達(dá)54%[11]。并且GTamy的酶學(xué)性質(zhì)(如熱穩(wěn)定、低pH、不依賴于Ca2+)使得其在淀粉液化工藝中具有巨大的應(yīng)用潛力。此外有關(guān)GTamy分子結(jié)構(gòu)特征與酶學(xué)性質(zhì)之間關(guān)系的研究具有重要理論價(jià)值,不僅有利于探討蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子適應(yīng)高溫環(huán)境的分子機(jī)制,也可以為其他α-淀粉酶的性質(zhì)優(yōu)化提供理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。GTamy的模擬分子結(jié)構(gòu)顯示其包含有三個(gè)保守的Ca2+結(jié)合位點(diǎn),其中兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域B之間,第三個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間[11]。來(lái)源于Bacillusstearothermophilus的α-淀粉酶BStA與GTamy具有98%序列相似性,Suvd等[12]發(fā)現(xiàn)位于α-淀粉酶BStA的結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于BStA的熱穩(wěn)定性非常重要。本研究擬對(duì)GTamy中位于結(jié)構(gòu)域A和結(jié)構(gòu)域C(也稱生淀粉結(jié)合域,raw starch binding domain,RSBD)之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,并通過(guò)比較GTamy與突變體的酶學(xué)性質(zhì)來(lái)揭示該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)GTamy酶學(xué)性質(zhì)的影響,初步闡述GTamy的分子結(jié)構(gòu)特征與其酶學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌EscherichiacoliJM109、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pSTOP1622 均由本實(shí)驗(yàn)室保存;基因gtamyh(編碼具有His tail的α-淀粉酶GTamyH) 由上海博益生物科技有限公司合成;KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司;DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國(guó)Fermentase公司;DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國(guó)Omega Bio-tek公司;Chelating SepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司;Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、木糖、咪唑 上海生工生物工程股份有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；LB培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g,固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L,用于大腸桿菌EscherichiacoliJM109和枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600的培養(yǎng),根據(jù)質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記需要,添加終濃度為30 μg/mL的卡那霉素。

PCR儀(Mastercycler gradient) 美國(guó)Eppendorf公司;TY04S-3C型凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;SP-752PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;Agilent 7500ce 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyds的構(gòu)建及鑒定 以P1和P2為引物(表1),以基因gtamyh為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得不含信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)基因gtamyhds。PCR擴(kuò)增條件為:98 ℃ 5 min;98 ℃ 20 sec,60 ℃ 20 sec,74 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);74 ℃,10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BglII和SphI雙酶切,連接至載體pSTOP1622,構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds。

采用NEB公司的Gibson Assembly Master Mix構(gòu)建包含枯草芽孢桿菌信號(hào)肽AbnA和重組載體pSTOP1622-gtamyhds的重組載體pSTOP1622-AbnA-gtamyhds。所需引物(表1中P3和P4)按照該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行設(shè)計(jì),PCR等相關(guān)操作按照該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體操作如下:以pSTOP1622-gtamyhds為模板,采用引物P3、P4(表1),進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到載體片段;PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 sec,55 ℃ 20 sec,68 ℃ 4 min,35個(gè)循環(huán);68 ℃,10 min。在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)查詢信號(hào)肽AbnA的核苷酸序列,合成包含同源臂和AbnA核苷酸序列的DNA片段(5′-CAAACTAGTTCGAAGATCT-信號(hào)肽核苷酸序列-ACGGCGTGGCAAATTGCCGTG-3′)。PCR擴(kuò)增的載體片段與上述DNA片段混合,采用Gibson Assembly Master Mix進(jìn)行無(wú)縫克隆,獲得重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds。以pSTOP1622-AbnA-gtamyhds為模板,采用引物P5、P2(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得包含信號(hào)肽AbnA基因序列和GTamyHds基因序列的約1600 bp的DNA片段。DNA片段測(cè)序(上海生工生物工程股份有限公司),比對(duì)分析。

1.2.2 重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)QuikChange?點(diǎn)突變?cè)噭┖械脑?結(jié)合α-淀粉酶GTamy基因gtamy和擬突變的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物D407A-F、D407A-R、D430A-F、D430A-R(表1)。以pSTOP1622-AbnA-gtamyhds為模板,采用引物D407A-F和D407A-R,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 sec,55 ℃ 20 sec,68 ℃ 4 min,35個(gè)循環(huán);68 ℃,10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶處理后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子,經(jīng)測(cè)序鑒定是否為突變基因gtamyhD407A。在此基礎(chǔ)上,以pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A為模板,采用引物D430A-F和D430A-R,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟,獲得重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A。

以pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A為模板,采用引物P5、P2(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得包含信號(hào)肽AbnA基因序列和GTamyHdsD407A/D430A基因序列的約1600 bp的DNA片段。將DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并與對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

1.2.3 枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的Spizizen法[13]進(jìn)行。

1.2.4 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶中培養(yǎng),裝液量20 mL,37 ℃和200 r/min下培養(yǎng)培養(yǎng)10 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),其中培養(yǎng)基的裝液量為25 mL,接種量為3%,培養(yǎng)溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min。當(dāng)培養(yǎng)至菌體OD600 nm達(dá)到1時(shí),添加終濃度為0.5%的木糖,誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì),誘導(dǎo)時(shí)間為30 h。

采用Ni2+親和層析柱對(duì)發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組α-淀粉酶。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳[14](Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測(cè)重組α-淀粉酶的純度,并采用Bradford法測(cè)定重組α-淀粉酶的濃度[15]。

1.2.5α-淀粉酶的酶活力測(cè)定 將10 μL酶液與490 μL 含1%(m/V)可溶性淀粉的50 mmol/L MES,pH5.0緩沖液混合,于80 ℃反應(yīng)30 min后,迅速放入冰水浴中終止反應(yīng),然后采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)法[16]測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位(U)定義:在一定反應(yīng)條件下,每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性測(cè)定 按照上述反應(yīng)體系混合酶液和底物,分別于30～100 ℃反應(yīng)30 min,測(cè)定不同溫度條件下酶比活力,并以酶比活力對(duì)溫度作圖,確定其最適反應(yīng)溫度。將酶液于80 ℃保溫,分時(shí)間梯度取出部分樣品,按照1.2.5節(jié)方法測(cè)定酶活。將未處理的酶液的酶活定義為100%,并以相對(duì)酶活的百分比對(duì)時(shí)間作圖,評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 用50 mmol/L MES(pH5.0)緩沖液配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)可溶性淀粉溶液(0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%),分別向可溶性淀粉溶液中加入等量的酶液,按照1.2.5的方法測(cè)定酶活。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),以酶比活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,直線的斜率為Km/Vmax,截距為1/Vmax,計(jì)算以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km、反應(yīng)常數(shù)kcat。

1.2.8α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH測(cè)定 將酶液與不同pH的1%(W/V)可溶性淀粉溶液混合,于80 ℃下進(jìn)行酶活測(cè)定。采用不同緩沖液配制不同pH的1%(W/V)可溶性淀粉溶液:50 mmol/L MES(pH3.0～7.0)、50 mmol/L MOPS(pH7.0～11.0)。

1.2.9α-淀粉酶對(duì)玉米淀粉的降解率及吸附率的測(cè)定 取30%(W/V)玉米淀粉的50 mmol/L MES(pH5.0)緩沖液與0.1 U/(mg淀粉)的酶液混合,于80 ℃反應(yīng)3 h后,用DNS法測(cè)定上清液中還原糖量。α-淀粉酶的玉米淀粉降解率按照如下公式計(jì)算:

玉米淀粉降解率(%)=還原糖(mg/mL)/起始生淀粉量(mg/mL)×0.9×100

取30%(W/V)生玉米淀粉的50 mmol/L MES(pH5.0)緩沖液與0.1 U/(mg淀粉)的酶液混合,混合體系在20 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h,振蕩速率為180 r/min。反應(yīng)結(jié)束后,測(cè)定上清液中的殘余可溶性淀粉酶活。吸附率AR計(jì)算公式如下:

AR(%)=(O-R)/O×100

R:上清液殘余酶活力;O:初始酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

采用Swiss-Model(http://swissmodel. expasy.org),以來(lái)源于Bacillusstearothermophilus的α-淀粉酶BStA(PDB ID:1hvxA)的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為模板,模擬GTamy的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。α-淀粉酶GTamy與BStA的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果(圖1)顯示:GTamy屬于糖苷水解酶類(lèi)的第13家族,具有第13家族酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制上的共同特征[11,17-19]。例如,GTamy的一級(jí)結(jié)構(gòu)含有四個(gè)保守區(qū)域,這四個(gè)保守區(qū)域包含酶分子的催化活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn);GTamy具有第13家族酶分子的保守的催化活性中心,由Asp268、Glu298及Asp365構(gòu)成;GTamy的三級(jí)結(jié)構(gòu)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,即結(jié)構(gòu)域A、結(jié)構(gòu)域B和結(jié)構(gòu)域C。

圖1 GTamy與α-淀粉酶BSA的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果Fig.1 Molecular structure comparison of α-amylase GTamy and BSA注:圖中方框標(biāo)示的是保守序列I～保守序列IV,實(shí)心圓形標(biāo)示的氨基酸殘基為α-淀粉酶BSA中位于結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的氨基酸殘基,實(shí)心三角形標(biāo)示的氨基酸殘基為GTamy中待突變的氨基酸殘基。BStA:來(lái)源于Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶(PDB ID:1hvxA);GTamy:來(lái)源于Geobacillus thermoleovorans的α-淀粉酶。

其中GTamy的結(jié)構(gòu)域C由8個(gè)β-sheet結(jié)構(gòu)構(gòu)成,GTamy的結(jié)構(gòu)域C和來(lái)源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶的生淀粉結(jié)合域RSBD序列比對(duì)結(jié)果表明,GTamy的結(jié)構(gòu)域C屬于生淀粉結(jié)合域RSBD[11]。生淀粉α-淀粉酶能夠直接水解未經(jīng)糊化處理的生淀粉顆粒的關(guān)鍵在于其具有結(jié)合到淀粉顆粒表面的生淀粉結(jié)合域RSBD[4,6]。RSBD作為淀粉酶的天然部分主要有以下作用:使淀粉酶分子可以在溶液中與不溶性底物(淀粉顆粒)結(jié)合,將底物運(yùn)送到催化結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)以及使淀粉顆粒表面破裂[20]。除此之外,RSBD還具有一些特殊功能。例如,Gt-amyⅡ的RSBD還與其熱穩(wěn)定性相關(guān)[21];AmyP的RSBD與其可溶性淀粉酶活相關(guān)[22-23]。

已有研究表明,α-淀粉酶中金屬離子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于其維持酶學(xué)性質(zhì)起到非常重要的作用。例如,Linden等[24]通過(guò)對(duì)比極端嗜熱α-淀粉酶PFA與其他低溫、中溫微生物來(lái)源的α-淀粉酶的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),PFA中Ca2+-Zn2+雙金屬離子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于其維持熱穩(wěn)定性非常重要;Machius等[25]和Qin等[26]發(fā)現(xiàn),位于α-淀粉酶BLA的結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域B之間的Ca2+-Zn2+-Ca2+三金屬離子結(jié)合位點(diǎn)以及位于其結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間的第三個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)有利于BLA維持熱穩(wěn)定性;曾靜等[27]的研究結(jié)果表明,位于極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域B之間Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的有利于其維持高溫活性和熱穩(wěn)定性;Suvd等[12]通過(guò)解析α-淀粉酶BStA的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),位于其結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于BSA的熱穩(wěn)定性非常重要。

BStA中位于結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的配基由多肽鏈骨架的三個(gè)羰基氧原子(Gly300、Phe302和Ser406)和兩個(gè)天冬氨酸殘基Asp(Asp407和Asp430)的羧基氧原子共同構(gòu)成[12]。根據(jù)GTamy和BStA的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果,GTamy中存在與BStA中該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基,即Gly303、Phe305、Ser406、Asp407和Asp430。由此推斷,GTamy的結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C之間也可能存在Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。本研究對(duì)該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)中的天冬氨酸殘基Asp407和Asp430進(jìn)行定點(diǎn)突變,研究該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)GTamy酶學(xué)性質(zhì)的影響。

2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

分別以重組質(zhì)粒pSTOP1622、pSTOP1622-AbnA-gtamyhds、pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A為模板,采用引物P5、P2對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物的電泳鑒定圖如圖2所示,以重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds和pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物大小均約為1.6 kb,與理論值相符。同時(shí)將以上得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果(結(jié)果未顯示)與對(duì)應(yīng)的基因序列進(jìn)行了比對(duì)確認(rèn),證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmids注:M1.1 kb ladder;1.質(zhì)粒pSTOP1622;2.質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds;3.質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A;4. 以質(zhì)粒pSTOP1622為模板,采用引物P5、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物;5. 以質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds為模板,采用引物P5、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物;6. 以質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A為模板,采用引物P5、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。

2.3 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將陰性對(duì)照pSTOP1622和重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds、pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600,獲得重組枯草芽孢桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。待表達(dá)完成后,收集發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體,采用SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液和發(fā)酵菌體中重組α-淀粉酶的表達(dá)情況。如圖3所示,目的蛋白質(zhì)GTamy和GTamyD407A/D430A均得到成功表達(dá),且主要位于發(fā)酵上清液中。GTamy和GTamyD407A/D430A的表觀分子質(zhì)量均約為60 kD,兩者的大小均與理論值相符。采用Ni2+親和層析柱對(duì)發(fā)酵上清液中的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,得到純化后的重組α-淀粉酶GTamy和GTamyD407A/D430A。

圖3 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE檢測(cè)圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases注:重組α-淀粉酶的SDS-PAGE檢測(cè)圖,其中C為含有質(zhì)粒pSTOP1622的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液樣品,A為含有重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液樣品,B為含有重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵上清液樣品,C1為含有質(zhì)粒pSTOP1622的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌體樣品,A1為含有質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌體樣品,B1為含有重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhdsD407A/D430A的重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌體樣品,A2采用Ni2+親和層析獲得的GTamy純化樣品,B2為采用Ni2+親和層析獲得的GTamyD407A/D430A純化樣品,箭頭所指為目的蛋白質(zhì)GTamy和GTamyD407A/D430A的位置。

2.4 GTamy和GTamyD407A/D430A的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.4.1 pH對(duì)重組α-淀粉酶相對(duì)酶活的影響 將酶液與不同pH(1.0～8.0)的1%(W/V)可溶性淀粉溶液混合,于80 ℃下測(cè)定重組α-淀粉酶的相對(duì)酶活,結(jié)果如圖4所示。重組α-淀粉酶GTamy和GTamyD407A/D430A的最適反應(yīng)pH均約為5.0,在pH3.0～11.0范圍內(nèi)兩者具有相似的相對(duì)酶活。以上結(jié)果表明,D407A/D430A雙位點(diǎn)突變不影響GTamy的反應(yīng)pH。

圖4 pH對(duì)酶活的影響Fig.4 pH dependence of α-amylase activity

2.4.2 溫度對(duì)重組α-淀粉酶比活力的影響 以1%可溶性淀粉為底物,于不同溫度條件下(30～100 ℃)測(cè)定重組α-淀粉酶的酶比活力,結(jié)果如圖5所示。重組α-淀粉酶GTamy和GTamyD407A/D430A的最適反應(yīng)溫度均為80 ℃,但是在40～100 ℃間GTamy的酶比活力均明顯高于突變體GTamyD407A/D430A的酶比活力。其中,在80 ℃條件下,GTamy的酶比活力為1 756.75 U/mg,突變體GTamyD407A/D430A的酶比活力為1 484.48 U/mg。這表明該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于GTamy維持其高溫活性非常重要。該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的缺失導(dǎo)致突變體于高溫條件下的酶比活力降低。

圖5 溫度對(duì)酶活的影響Fig.5 Temperature dependence of α-amylase activity

2.4.3 重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 重組α-淀粉酶以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km和反應(yīng)常數(shù)kcat如表2所示,與GTamy相比,80 ℃時(shí)突變體GTamyD407A/D430A的Km未明顯改變,kcat值明顯降低。即突變體GTamyD407A/D430A的可溶性淀粉結(jié)合能力未明顯改變,以可溶性淀粉為底物時(shí)的反應(yīng)速率明顯下降。突變體GTamyD407A/D430A于80 ℃條件下以可溶性淀粉為底物的反應(yīng)速率為GTamy的79%。以上結(jié)果表明,該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)是通過(guò)影響GTamy的反應(yīng)速率來(lái)影響其高溫活性的。

表2 80 ℃重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of recombinant α-amylases at 80 ℃

2.4.4 重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性 重組α-淀粉酶于80 ℃下的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖6所示。在80 ℃的條件下,GTamy的熱穩(wěn)定性高于突變體GTamyD407A/D430A的熱穩(wěn)定性。其中GTamy于80 ℃的半衰期約為3 h,GTamyD407A/D430A于80 ℃的半衰期約為2.5 h。這表明,該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)與GTamy的熱穩(wěn)定性相關(guān),這與α-淀粉酶BStA中相對(duì)應(yīng)的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的功能相同。

圖6 80 ℃重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of α-amylases at 80 ℃

2.4.5 重組α-淀粉酶對(duì)玉米淀粉的吸附率及降解率 通過(guò)測(cè)定重組α-淀粉酶對(duì)玉米淀粉的吸附率和降解率來(lái)比較重組α-淀粉酶對(duì)不溶性底物的結(jié)合能力和降解能力,結(jié)果如表3所示。與GTamy相比,突變體GTamyD407A/D430A對(duì)玉米淀粉的吸附率和降解率均明顯降低。在同等條件下,GTamyD407A/D430A對(duì)玉米淀粉的吸附率僅為GTamy的67.9%;GTamyD407A/D430A對(duì)玉米淀粉的降解率僅為GTamy的59.3%。

表3 重組α-淀粉酶對(duì)玉米淀粉的吸附率及降解率Table 3 Substrate binding rate and hydrolysis rate of α-amylases towards corn starch

3 結(jié)論

本研究率先通過(guò)構(gòu)建GTamy的定點(diǎn)突變體GTamyD407A/D430A來(lái)研究位于結(jié)構(gòu)域A與結(jié)構(gòu)域C(即生淀粉結(jié)合域RSBD)之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)(如熱穩(wěn)定性、對(duì)可溶性淀粉的結(jié)合能力和降解能力、對(duì)生淀粉的結(jié)合能力和降解能力等)的影響。與GTamy相比,突變體GTamyD407A/D430A的高溫活性和熱穩(wěn)定性明顯降低。GTamyD407A/D430A于80 ℃的酶比活力由1756.75 U/mg降低至1484.48 U/mg;于80 ℃的半衰期由3 h降低至2.5 h。此外,突變體GTamyD407A/D430A對(duì)可溶性淀粉的結(jié)合能力未明顯改變,對(duì)可溶性淀粉的降解能力以及對(duì)玉米淀粉的結(jié)合能力和降解能力明顯降低。以1%可溶性淀粉為底物時(shí),GTamyD407A/D430A的底物結(jié)合能力不變,反應(yīng)速率僅為GTamy的79%;以30%玉米淀粉為底物時(shí),突變體的底物吸附率為GTamy的67.9%,底物降解率為GTamy的59.3%。本研究結(jié)果表明,位于GTamy的結(jié)構(gòu)域A與RSBD之間的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)有利于其維持熱穩(wěn)定性和高溫活性。該Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的突變可能通過(guò)改變GTamy的分子結(jié)構(gòu),特別是生淀粉結(jié)構(gòu)域RSBD和酶分子催化中心的分子結(jié)構(gòu),影響GTamy的酶學(xué)性質(zhì)。本研究初步闡述了GTamy的分子結(jié)構(gòu)特征與其酶學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系,為其他α-淀粉酶的分子改造提供了理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。