油茶餅粕多糖的分級及其抗氧化性評價

石 浩,何小娥,黃衛(wèi)文,胡玉玲,樊紹剛,王文龍,*

(1.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院,湖南常德415100;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南長沙 410128)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)屬油茶屬茶科,常綠小喬木[1-2],主要種植在湖南、江西兩省,占據(jù)全國總種植面積的60%以上[3]。在獲取茶油的同時,每年油茶餅粕的產(chǎn)量也十分巨大,目前年產(chǎn)量已高達40萬噸以上,多年來它被作為一種“廢棄物”,而常常被人忽視[4-5]。目前國內(nèi)油茶餅粕大部分被用作物肥料及動物飼料的原材料中,很少有做進一步的開發(fā)利用,油茶餅粕中含有一定量的代謝產(chǎn)物,其中多糖類含量高達30%以上。多糖作為油茶餅粕中的主要物質(zhì),具有一定的保健作用,如提高免疫力[6]、抗氧化、抗衰老[7-9]、降血糖[10]、抗腫瘤等[7,11]。因此,對油茶餅粕中多糖類物質(zhì)的利用與活性研究是非常具有必要性的。

生態(tài)環(huán)境日益嚴(yán)重的污染以及人類精神、物質(zhì)生活壓力的增加,都將直接或間接導(dǎo)致人體內(nèi)自由基含量的增加。由于自由基屬于體內(nèi)的一種高能分子,也破壞細胞膜,降低細胞活性,加速細胞內(nèi)沉積物的生成,常會引發(fā)一些心腦血管病、癌癥等高發(fā)的慢性疾病[12-13],因此對油茶餅粕多糖清除自由基活性方面的研究,以及開發(fā)相應(yīng)清除自由基的保健品尤為重要。近年來,國內(nèi)外在多糖清除自由基方面的研究比較多[14],但對其純化多糖與其他物質(zhì)協(xié)同抗氧化作用的研究較少。有相關(guān)報道稱[15],有些復(fù)合劑活性相比單一藥劑,具有活性高、成本低等優(yōu)點,為避免高劑量帶來的食品安全問題,有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕 湖南省常德市丁家港鎮(zhèn)油茶果經(jīng)榨取茶油后所得副產(chǎn)物;DEAE-52纖維素、Sephadex G-100葡聚糖凝膠、DPPH自由基、木瓜蛋白酶(酶活≥60萬U/g) Sigma公司;Dextran T-10、T-40、T-100、T-200、T-500系列標(biāo)準(zhǔn)多糖 Solarbio公司;VE、VC、氯化鈉、無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、葡萄糖、98%濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、鄰苯三酚、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、Na2HPO4、NaH2PO4國藥集團化學(xué)試劑有限公司;有機試劑 均為分析純。

THZ-92B型可調(diào)速控溫搖床 上海浦東物理儀器廠;ZW1105051705型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;SB-3200D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;AUW220D型電子天平 日本shimadzu公司;DR-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TG16型臺式高速離心機 長沙英泰儀器有限責(zé)任公司;DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;Thermo Savznt冷凍干燥儀 上海智巖科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖供試液的制備 取10 g油茶餅粕粉末經(jīng)3.0%木瓜蛋白酶反應(yīng)3.0 h后,75 ℃熱水(1∶30 (g∶mL))、1000 W超聲提取,提取3次,每次45 min[17]。抽濾棄去渣,合并濾液,提取液經(jīng)濃縮至30 mL左右,加入1/3體積的Sevag試劑[氯仿∶正丁醇=4∶1 (V∶V)],混合振蕩15 min后,靜置10 min,除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質(zhì)。濾液經(jīng)60 ℃減壓蒸餾濃縮至15 mL體積后,加入最終濃度為75%的乙醇,沉淀得粗多糖。粗多糖用20 mL丙酮洗滌多次,得到初步純化多糖溶液,將其濃縮至浸膏狀后,-80 ℃冷凍干燥成粉末,稱重約0.76 g,4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多糖組分的分離純化 取約50 mg/mL的多糖水溶液10 mL,分別相繼上樣于DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100葡聚糖柱進行柱層析,用0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl進行分段梯度洗脫,每個濃度的洗脫體積為90 mL;洗脫流速為1.0 mL/min,收集洗脫液,5 mL/管,采用硫酸-苯酚法顯色跟蹤測定,共分離出5個對稱性較好、純度較高的多糖組分,依次命名為:DTA、DTB、DTC1、DTC2、DTD。合并各多糖組分的洗脫液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃,經(jīng)60 ℃減壓縮至浸膏狀;濃縮液經(jīng)-80 ℃冷凍干燥至粉末狀,測定其含量、純度備用。

1.2.3 多糖含量及純度的測定

1.2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 移液槍分別精密移取濃度為100 μg/mL的葡萄糖對照品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.00 mL于6支20 mL玻璃試管中,加入5.0%苯酚溶液1 mL,并迅速加入濃硫酸5 mL,搖勻,常溫靜置20 min后沸水浴3 min,取出后迅速冷卻至室溫,各試管中加蒸餾水補至10 mL,在490 nm處測定吸光值。精密量取蒸餾水1 mL同上述操作,作為空白對照,以糖濃度為橫坐標(biāo)(x),吸光值為縱坐標(biāo)(y)得回歸方程:y=0.0095x+0.0045(R2=0.9993)。

1.2.3.2 多糖含量的測定 取上述所得多糖粉末0.05 g,用蒸餾水溶解至1000倍體積后,取1 mL稀釋液采用硫酸-苯酚法測定多糖含量,經(jīng)換算得總多糖為0.511 g,其計算公式如下。

多糖含量(mg)=Ci×V×N×10-3

其中,Ci為樣品測定吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)濃度(μg/mL);V為樣品測定時體積(1 mL);N為樣品稀釋倍數(shù)(1000)。

1.2.3.3 多糖純度的測定 粗多糖經(jīng)層析柱分離后,收集合并含相同組分的洗脫液,濃縮至浸膏狀后,-80 ℃冷凍干燥至粉末,分別稱量和測定各組分多糖的質(zhì)量,計算純度。

其中,Ai為多糖樣品測定質(zhì)量(mg);Aj為多糖樣品稱量質(zhì)量(mg)

1.2.4 多糖分子量范圍的確定 采用葡聚糖柱層析法。將濃度為5 mg/mL的Dextran T-10、T-40、T-100、T-200、T-500系列標(biāo)準(zhǔn)多糖0.1 mL分別相繼上樣,用雙蒸水洗脫,每5 mL一管收集流出液,苯酚-硫酸法顯色,收集合并洗脫液,求得洗脫體積(Ve),用Dextran T-2000同法測得柱床體積V0,以Ve/V0為橫坐標(biāo),相對分子質(zhì)量對數(shù)(lgM)為縱坐標(biāo),求得回歸方程:y=-0.194x+5.9377(R2=0.9991)。各組分多糖均采用同法上柱得體積Ve′,根據(jù)Ve′/V0值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,求得其相應(yīng)多糖組分的分子量。

1.2.5 多糖組分抗氧化能力的測定

1.2.5.1 還原能力測定 參照郝旭梅等[18]方法并稍作修改。用移液槍移取1.0 mL不同濃度、不同組分多糖溶液于10 mL玻璃試管中,同時加入1.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)以及1.5 mL濃度為1.0%的K3Fe(CN)6溶液,混勻,在55 ℃的水浴鍋中反應(yīng)25 min后冷水浴冷卻,再加入1.5 mL濃度為10%的三氯乙酸溶液,搖勻振蕩3 min后加入4 mL蒸餾水和0.20%的FeC13溶液0.5 mL,搖勻,充分反應(yīng)10 min后測定吸光值A(chǔ)700 nm,每個樣品測三次平行,以蒸餾水作為樣品空白對照。

1.2.5.2 羥自由基(·OH)清除力測定 參照景永帥等[19]方法并稍作修改。用移液槍移取1.0 mL不同濃度、不同組分多糖溶液于10 mL玻璃試管中,同時加入1.0 mL濃度為15 mmol/L的FeSO4溶液以及1.0 mL濃度為15 mmol/L的雙氧水溶液,混勻,常溫下反應(yīng)10 min后加入1.0 mL濃度為15 mmol/L的水楊酸溶液,搖勻,常溫下反應(yīng)30 min后補加蒸餾水1.0 mL,在510 nm處測定樣品組吸光值A(chǔ)i,樣品背景吸光值A(chǔ)j,以及蒸餾水作為樣品空白對照吸光值A(chǔ)o,每個樣品測三次平行。

1.2.5.4 DPPH自由基清除力測定 參照劉軍軍等[21]方法并稍作修改。稱取適量粗多糖、不同組分多糖及VC與VE,配成不同濃度的溶液。分別取不同濃度溶液1.0 mL,用50%乙醇補加至4.0 mL,再加0.5 mg/mL的DPPH溶液1.0 mL,搖勻,在室溫避光反應(yīng)30 min后在517 nm波長處測其吸光度Ai;樣品背景吸光值A(chǔ)j;對照組以等體積50%乙醇代替樣品溶液,測定吸光度A0,計算公式同1.2.5.2。

1.2.6 Isobologram分析法研究多糖與VC、VE的相互作用 以多糖、VC、VE單獨作用的IC50值的比值作為參考,選擇多糖與VE的固定比例(質(zhì)量濃度比)為1∶1、3∶1、9∶1,多糖與VC的固定比例為1∶1、6∶1、36∶1,按固定比例混合后,以同樣的方法測定其對DPPH自由基的清除能力,計算清除率及復(fù)合組的IC50值。

對藥物之間相互作用關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析[22-23]。按如下公式計算IC50add:

式中:R為A、B兩種抗氧化劑單獨應(yīng)用時的效價比,即R=IC50A/IC50B;P1為抗氧化劑A在復(fù)配組中所占的比例;P2為抗氧化劑B在復(fù)配組中所占的比例,P2=1-P1。由實驗可以得到復(fù)配組實際的IC50 mix值,比較理論上的IC50add和實驗得到的IC50 mix,確定是否存在顯著性差異,若IC50 mix值小于IC50add值,表示相互作用為協(xié)同作用。

再計算相互作用指數(shù)(γ),常用其來評價協(xié)同或拮抗作用的程度。

式中：IC50Amix、IC50Bmix分別為復(fù)配組中A、B兩種抗氧化劑的IC50值;IC50A、IC50B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨作用時的IC50值。若γ<1,表示相互作用為協(xié)同作用,γ值越小說明協(xié)同作用越強;若γ>1,表示相互作用為拮抗作用;若γ=1,表示相互作用為相加[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin制圖,各抗氧化指標(biāo)實驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進行顯著性分析。圖表中不同小寫字母表示α=0.05顯著性水平,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖柱層析洗脫圖譜

取約50 mg/mL的多糖水溶液10 mL,依次上樣于已經(jīng)預(yù)處理好的纖維素柱和葡聚糖凝膠柱,實驗結(jié)果由圖1可知,共得到5個對稱性好,無重疊,純度較高的多糖組分,分別命名為DTA、DTB、DTC1、DTC2、DTC3、DTD(其中DTC在葡聚糖凝膠柱中得到進一步分離純化出3個組分)。由此圖1可知油茶餅粕多糖經(jīng)DEAE-52纖維素和SephadexG-100葡聚糖凝膠柱層析后可得到純度較高的不同多糖組分。

圖1 多糖洗脫曲線圖譜Fig.1 Curve of polysaccharide elution

2.2 多糖組分含量、純度及分子量的確定

各組分多糖的分子量大小均不一樣,且有較大差別;通過柱分離所得多糖組分,計算各組分的含量及純度。實驗結(jié)果如表1所示,可看出隨著多糖洗脫體積的增加,多糖的分子量不斷的減小;DTA最先被洗脫出來,分子質(zhì)量最大,在50萬左右,其后組分DTB、DTC1、DTC2分別被洗脫出來,分子量依次為20萬、10萬、5萬左右,DTD最后被洗脫出來,分子量最小,在4萬左右。各組分多糖的純度差別不大,在80%左右;含量有一定的差異,DTA、DTB、DTC1的含量在25%左右,其余兩個組分在10%左右。

表1 不同組分多糖的確定(n≥3)Table 1 Determination of different components of polysaccharide(n≥3)

2.3 多糖抗氧化能力的測定

2.3.1 還原能力的測定 不同組分及不同濃度下多糖還原性能力的大小有較大的差別,其測定結(jié)果如圖2所示,各組分多糖隨著其濃度的增加,還原能力逐漸增強,具有一定的正相關(guān)性,在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi),還原力增加了4.3～11.5倍。在(1.0 mg/mL濃度下)不同多糖組分間還原力的大小依次為:DTC1>DTC2>DTA>DTD>DTB,DTC1(0.527)相對于DTB的還原力提高了1.7倍,說明各組分多糖由于其結(jié)構(gòu)以及分子量的不一樣,最終導(dǎo)致其自身還原力也相差較大。因此,在今后對油茶餅粕多糖類抗氧化產(chǎn)品開發(fā)時可選擇10萬左右分子量的多糖。

圖2 不同組分多糖的還原力Fig.2 Reducing power of polysaccharides from different components注:圖中不同字母表明差異顯著(p<0.05);圖3～圖6同。

2.3.2 ·OH自由基清除力測定結(jié)果 不同組分及不同濃度下多糖對·OH自由基清除力的大小也具有一定的差異,其測定結(jié)果如圖3所示,隨著各組分多糖底物濃度的增加,·OH自由基清除能力逐漸增強,在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),.OH自由基清除能力增加迅速,如DTC1在0.5 mg/mL時清除率增加了60.50%;0.5～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),·OH自由基清除能力增加也較為迅速,但當(dāng)濃度≥1.5 mg/mL時,·OH自由基清除能力逐漸趨于平穩(wěn)。在2.0 mg/mL濃度下,不同多糖組分間·OH自由基清除能力的大小依次為:DTC1>DTA>DTC2>DTD>DTB,DTC1(78.92%)相對于DTB提高了31.00%。

圖3 不同組分多糖的·OH自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of ·OH radical in different fractions of polysaccharides

圖4 不同組分多糖的超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of superoxide anion radical in different fractions of polysaccharides

2.4 多糖、VC、VE清除DPPH自由基能力的比較

在一定濃度范圍之內(nèi),各組分多糖、VC、VE對DPPH自由基的清除能力與濃度呈量效關(guān)系,后均逐漸趨于穩(wěn)定。由圖5、圖6可知,多糖具有較強清除自由基的能力,其中DTC1抑制效果最佳,當(dāng)其質(zhì)量濃度達到2.0 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率可達到80%以上。多糖(DTC1)、VE、VC的IC50值分別為0.833、0.266、0.135 mg/mL,即清除DPPH自由基的能力依次為VC>VE>多糖。DTC1與VC及VE的IC50值比率分別為1∶0.162、1∶0.319,后續(xù)選擇3組固定比例做復(fù)配物抗氧化測定。

圖5 不同組分多糖的DPPH自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of DPPH radical in different fractions of polysaccharides

圖6 VC、VE的DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH radical in VC、VE

2.5 Isobologram分析法評價多糖與VC、VE的相互作用

2.5.1 DTC1與VC、VE復(fù)配后清除DPPH自由基能力的測定 多糖(DTC1)和VC的固定比例均定為1∶1、6∶1、36∶1,DTC1和VE的固定比例均定為1∶1、3∶1、9∶1,VC、VE固定比例中的質(zhì)量濃度選擇0.01～0.50 mg/L,DTC1固定比例中的質(zhì)量濃度選擇0.01～2.50 mg/L較為適宜。以同樣的方法測定復(fù)合抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用(表2);再由表2計算出多糖與VC、VE組成的復(fù)配抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用的IC50值(表3)。

表2 DTC1與VC、VE復(fù)配后對DPPH自由基的清除能力(n≥3)Table 2 DPPH radical scavenging capacity of DTC1combined with VC or VE(n≥3)

2.5.2 DTC1與VC、VE復(fù)配后的統(tǒng)計學(xué)分析 按1.2.6所述方法及相應(yīng)公式計算復(fù)配組(表2)理論上的IC50add值和相互作用指數(shù)γ,結(jié)果見表3。由表3可出,各種組合的IC50 mix值均小于IC50add值,經(jīng)過t檢驗證明兩者之間有一定差異性,且相互作用指數(shù)γ都小于1,表明多糖與VC、VE的相互作用為協(xié)同作用。γ值越小說明協(xié)同作用越強,由此可得多糖與VC復(fù)配組的協(xié)同作用略弱于多糖與VE復(fù)配組,兩組均是1∶1配比的協(xié)同作用效果最好,其次是多糖與VE(1∶36)復(fù)配組。

表3 DTC1與VC、VE復(fù)配后清除DPPH自由基的IC50值及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果Table 3 IC50 value and statistical analysis of DPPH radical scavenging by DTC1 and VC、VE

2.5.3 DTC1與VC、VE復(fù)配后的Isobologram分析圖 根據(jù)圖5、圖6、表3所測得IC50值標(biāo)繪在Isobologram分析圖上(圖7、圖8)。將DPPH自由基清除實驗中得到的DTC1的IC50值和95%可信限標(biāo)繪在縱軸上,VC和VE的IC50值和95%可信限標(biāo)繪在橫軸上,將兩IC50值相連后構(gòu)成相加線,將兩可信限分別相連后作出相加線95%可信限。若復(fù)合多糖(DTC1)效應(yīng)(復(fù)配點IC50)落在相加效應(yīng)線上或可信限內(nèi),則表示兩藥作用為相加;如落在相加效應(yīng)線的可信限左側(cè),則代表協(xié)同作用;如落于右側(cè),則為拮抗作用。由圖7、圖8可知,復(fù)配組的效應(yīng)點均落在相加線和95%可信限的左側(cè),表明DTC1與VC、VE復(fù)配后存在協(xié)同抗氧化作用。

圖7 DTC1與VC復(fù)配的Isobologram分析圖Fig.7 Isobolographic plot of DTC1 from Camellia cakes combined with VC注:相加線上的空心點(○)代表理論IC50add值,實心點(●)代表實驗IC50 mix值;圖8同。

3 結(jié)論

4 討論

多糖組分得到柱分離,以及不同組分多糖抗氧化性差異可能是由于各組分多糖的單糖組成、極性大小、質(zhì)量大小、黏度大小、空間構(gòu)象等一些因素不一樣所導(dǎo)致[25-26],在后期實驗中可進一步對不同組分多糖結(jié)構(gòu)的測定,探討其結(jié)構(gòu)、組成與抗氧化能力大小的關(guān)系。目前抗氧化劑復(fù)配在一起發(fā)揮協(xié)同作用的機理主要有修復(fù)再生或新生、偶聯(lián)氧化、吸收氧氣、改變酶的活性、絡(luò)合金屬離子等[27-29],影響協(xié)同作用強弱的因素主要有兩種物質(zhì)的平衡濃度及其配比等。今后可在本文的基礎(chǔ)上進行進一步實驗,研究多糖協(xié)同抗氧化的具體機理及其發(fā)揮最佳協(xié)同作用的平衡濃度,從而最大程度上節(jié)約成本,更好地指導(dǎo)生產(chǎn)與實踐。