腺苷預(yù)處理的局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能觀察

裴科陽，譚軍，夏艷紅，尉娜，王英，趙欣，郭升

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院；4新鄭市人民醫(yī)院；5新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

隨著生活水平的提高、膳食結(jié)構(gòu)的不合理、社會(huì)人口的老齡化，腦血管疾病發(fā)生率較以往有明顯的升高，其中缺血性卒中占有較高的比例。以往研究結(jié)果表明，缺血再灌注損傷可以明顯加重腦卒中的發(fā)展；有許多因素涉及這種病理過程，包括興奮性氨基酸中毒、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣過載、炎癥反應(yīng)和凋亡。當(dāng)前治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是抑制腦缺血再灌注損傷，因此應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑改善腦缺血再灌注損傷越來越受到關(guān)注。腺苷是一種可以在人體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性核苷，在能量消耗和缺血缺氧的情況下通過激活四種G蛋白偶聯(lián)受體(A1R、A2aR、A2bR、A3R)使得組織和細(xì)胞能夠適應(yīng)其損害。許多實(shí)驗(yàn)表明[1～3]，腺苷對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。腦組織對缺血缺氧十分敏感，而且神經(jīng)細(xì)胞全部進(jìn)行有氧代謝，需要線粒體提供能量來維持神經(jīng)元正常生理功能，腦缺血缺氧會(huì)造成線粒體功能結(jié)構(gòu)的損傷。線粒體是腦組織缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵亞細(xì)胞靶區(qū)，神經(jīng)元能否存活與線粒體的功能完整性有著緊密聯(lián)系。因此，保護(hù)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)鍵是保護(hù)線粒體，但既往腺苷對缺血再灌注損傷線粒體功能的影響方面的研究暫時(shí)未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察了腺苷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的影響，旨在為缺血性腦血管病的治療以及神經(jīng)細(xì)胞線粒體保護(hù)作用機(jī)制做初步的探索，以期尋找該疾病治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(250±30)g，飼養(yǎng)于溫度濕度通風(fēng)良好的動(dòng)物房，室內(nèi)溫度控制在(25±2)℃，不限制飲水及進(jìn)食。

1.2 腺苷、儀器及試劑 腺苷，鈣熒光探針Fura-2AM，MCAO栓線-2626系列，組織線粒體分離試劑盒，BCA蛋白濃度檢測試劑盒，PMSF(100 mmol/L)，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)，超微量Na+-K+-ATP酶測試盒，三磷酸腺苷(ATP)測試盒，多功能酶標(biāo)儀，熒光分光光度計(jì)，紫外可見分光光度計(jì)752N。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、腺苷應(yīng)用方法及模型制備 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組各10只，腺苷組大鼠制模前3 d腹腔注射腺苷注射液1.5 mg/kg(生理鹽水稀釋至2 mL)，1次/d，連續(xù)3 d；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。腺苷組和模型組大鼠制備大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，即應(yīng)用MCAO栓線制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型。給予8%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)于SD大鼠腹腔注射進(jìn)行術(shù)前麻醉，將成功麻醉后的大鼠取仰臥位固定于大鼠解剖專用手術(shù)臺上，頸部正中皮膚進(jìn)行備皮并消毒，使用彎鑷提起頸部正中皮膚縱向切開皮膚長約2～2.5 cm，使用彎鑷沿肌束方向鈍性分離肌肉，避免肌肉的損傷或離斷，使用玻璃分針對血管、周圍神經(jīng)、筋膜等組織進(jìn)行分離，分離過程中動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免造成大鼠神經(jīng)或血管的離斷。充分暴露大鼠的左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，使用無菌縫線將CCA、ECA結(jié)扎，動(dòng)脈夾充分夾閉ICA后，使用眼科剪在CCA離ICA、ECA交叉口上1.0 cm剪出斜形小口，把備好的MCAO栓線小心插入斜形小口后，結(jié)扎CCA，栓線頭進(jìn)入到ICA后及時(shí)松開ICA上的動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入尼龍線，使其到達(dá)至大腦中動(dòng)脈(MCA)處，栓線上標(biāo)記的黑點(diǎn)行至動(dòng)脈交叉處，插入的深度長約為18～20 mm，將MCA的血流予以阻斷。固定結(jié)扎尼龍線，然后進(jìn)行縫皮、消毒，皮膚外的尼龍線使用記號筆涂黑。于栓塞2 h后，固定大鼠將尼龍線輕輕拔出約1 cm，恢復(fù)大鼠大腦中動(dòng)脈及Willis環(huán)的血液供應(yīng)。假手術(shù)組僅切開頸部皮膚后，分離暴露ICA、ECA、CCA而不結(jié)扎，隨后進(jìn)行逐層縫合并給予消毒，將大鼠放置在電熱毯上，保持肛溫在37.0 ℃左右，密切觀察大鼠生命體征。醒后參照Zeal Longa 5級評分法行神經(jīng)功能評分，1～3分為有效模型，0分和4分者為無效模型。

1.4 腦組織神經(jīng)細(xì)胞線粒體制備 各組大鼠在腦缺血再灌注22 h后處死，冰上斷頭取腦，快速取左側(cè)大腦半球并稱重，4 ℃生理鹽水洗滌組織，眼科剪將腦組織剪成細(xì)小碎片，按照組織線粒體提取試劑盒(碧云天)說明書進(jìn)行兩次差速離心法進(jìn)行操作，分離得到神經(jīng)細(xì)胞線粒體后加入線粒體儲存液，制備成神經(jīng)細(xì)胞線粒體懸液，線粒體蛋白含量應(yīng)用BCA試劑盒檢測，新鮮線粒體懸液用于膜電位及鈣離子檢測，余分裝保存于-80 ℃冷凍保存。

1.5 線粒體基質(zhì)Ca2+檢測 取部分新鮮配制的神經(jīng)細(xì)胞線粒體，將50 μL的Fura-2/AM(1 mmol/L)加入神經(jīng)細(xì)胞線粒體懸液中，渦旋混勻，將神經(jīng)細(xì)胞線粒體懸液在37 ℃水浴中孵育30 min進(jìn)行負(fù)載。調(diào)整線粒體蛋白含量為1 mg/mL，根據(jù)Grynkiewicz的方法[4]，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)檢測神經(jīng)細(xì)胞線粒體基質(zhì)Ca2+。

1.6 神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位檢測 采用JC-1試劑盒。取新鮮神經(jīng)細(xì)胞線粒體懸液，按照試劑盒說明操作，用熒光酶標(biāo)儀檢測(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長590 nm)，得到相對熒光單位(RFU)，RFU值高表明神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位正常。

1.7 神經(jīng)細(xì)胞線粒體ATP含量、Na+-K+-ATPase活性檢測 -80 ℃分裝保存的神經(jīng)細(xì)胞線粒體懸液常溫下凍融后，分別取100 μL的神經(jīng)細(xì)胞線粒體混懸液，按試劑盒說明書檢測ATP含量以及Na+-K+-ATPase活性。規(guī)定每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活性單位。

2 結(jié)果

2.1 兩組神經(jīng)細(xì)胞線粒體基質(zhì)Ca2+濃度、膜電位比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組神經(jīng)細(xì)胞線粒體基質(zhì)Ca2+濃度、膜電位比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.2 兩組神經(jīng)細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATPase活性、ATP含量比較 結(jié)果見表2。

表2 兩組神經(jīng)細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATPase活性、ATP含量比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

研究[5]表明，腦缺血再灌注損傷的病理生理過程非常復(fù)雜，這些過程是相互重疊或相互關(guān)聯(lián)的，最終導(dǎo)致神經(jīng)壞死或凋亡。還有研究[6]表明，缺血性卒中不僅減少閉塞動(dòng)脈的血流和組織氧含量，而且減少大腦循環(huán)的其他區(qū)域供血和供氧，腦缺血缺氧發(fā)生時(shí)可以導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，并通過影響線粒體代謝的關(guān)鍵酶，包括氧化磷酸化相關(guān)酶(NADH脫氫酶、COX)和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶(丙酮酸脫氫酶β、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰化酶、脂肪酸、氨基酸代謝相關(guān)酶)的表達(dá)影響線粒體的能量供應(yīng)，造成ATP合成下降[7,8]，而線粒體損傷則是其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[9]。氧化應(yīng)激在再灌注過程中引起的線粒體功能障礙是腦缺血再灌注損傷的一個(gè)關(guān)鍵致病機(jī)制[10]，腦缺血再灌注在極短時(shí)間內(nèi)即可損傷線粒體，隨后氧化應(yīng)激長時(shí)間損傷線粒體，最終造成線粒體的永久性破壞[11,12]。腦組織缺血再灌注后ROS大量生成，其會(huì)損傷線粒體的蛋白質(zhì)和mtDNA等，并通過直接和間接的途徑調(diào)控MPTP開放，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，引起線粒體膜電位下降，釋放凋亡相關(guān)蛋白，啟動(dòng)線粒體凋亡通路[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后過高的氧化應(yīng)激水平和鈣超載可以引起MPTP持續(xù)性開放[13]，致使線粒體膜通透性改變，并最終導(dǎo)致線粒體崩解，進(jìn)一步觸發(fā)線粒體凋亡，最終引起細(xì)胞死亡[14]。

腺苷是一種重要的核苷信號，在能量消耗和缺血缺氧的情況下通過激活四種G蛋白偶聯(lián)受體(A1R、A2aR、A2bR、A3R)使得組織和細(xì)胞能夠適應(yīng)其損害。細(xì)胞外腺苷對應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)和產(chǎn)生是保護(hù)組織的關(guān)鍵。腺苷通過激活其腺苷受體參與許多重要的生理過程，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫反應(yīng)、血管功能和代謝[15]。腺苷介導(dǎo)的生物學(xué)功能主要依賴于腺苷受體的激活，這些細(xì)胞表面受體的反應(yīng)主要由腺苷濃度決定。由于生理?xiàng)l件下腺苷含量一般低于1 μmol/L，因此腺苷信號的大部分功能是通過激活A(yù)1、A2a、A3受體，其EC50值介于0.01～1 μmol。相比之下，A2b受體的激活需要更高腺苷濃度，一般在病理生理?xiàng)l件下存在。隨著各種腺苷受體激動(dòng)劑或拮抗劑和四種腺苷受體敲除小鼠模型的發(fā)展和產(chǎn)生，腺苷信號傳導(dǎo)已被證明是病理生理?xiàng)l件下通過調(diào)節(jié)炎癥，缺血性組織損傷，纖維化和組織重構(gòu)[16～18]。研究發(fā)現(xiàn)腺苷在缺血性腦血管病、癲癇、疼痛、肺纖維化等多種疾病中具有保護(hù)作用。研究[19～21]發(fā)現(xiàn)，通過腺苷的預(yù)處理，可以明顯改善大鼠再灌注損傷引起的神經(jīng)功能缺失癥狀，并且減輕了腦組織的損傷程度，同時(shí)增加了缺氧誘導(dǎo)因子-1、紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子的含量，從而起到對腦組織的保護(hù)，證實(shí)腺苷有腦保護(hù)作用。

線粒體功能的完整性在細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用。反映線粒體功能狀態(tài)的指標(biāo)也非常多，在細(xì)胞的各種生理、病理過程中,ATP是重要的能量分子，一般ATP含量的降低可以說明線粒體的功能下降或者損傷；另外ATP酶存在于細(xì)胞或者細(xì)胞器的膜上，它在能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)送以及信息傳遞方面具有重要作用，機(jī)體存在缺血缺氧時(shí)，ATP酶活性會(huì)明顯下降，影響線粒體功能，造成毒性物質(zhì)堆積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，影響正常細(xì)胞生理功能；線粒體膜電位是評估線粒體的敏感指標(biāo)，其下降是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志，可以反映早期線粒體功能的損害的敏感指標(biāo)；線粒體內(nèi)Ca2+濃度增高在缺血再灌注損傷中起到重要用，可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。本文結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATPase活性明顯下降，ATP含量降低，膜電位明顯降低，提示腦組織神經(jīng)細(xì)胞受損，線粒體處于凋亡狀態(tài)；神經(jīng)細(xì)胞線粒體基質(zhì)Ca2+含量增加，表明腦缺血再灌注后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，引起線粒體攝取鈣離子增多并導(dǎo)致線粒體內(nèi)鈣離子的過度聚集，抑制ATP的合成，腦缺血后線粒體損傷可能與線粒體內(nèi)Ca2+超載密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，腺苷組Na+-K+-ATPase活性和ATP含量升高，線粒體鈣離子濃度明顯降低，提示腺苷預(yù)處理對大鼠缺血再灌注腦組織線粒體功能的損傷具有保護(hù)作用。

總之，腺苷預(yù)處理能夠改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞線粒體的功能。