飲用天門冬水煎劑的SD大鼠學(xué)習(xí)記憶、空間探索能力及炎癥因子水平、神經(jīng)酶活性觀察

劉洋，王飛清，陶奕汐，何秀麗，楊劍，李紅日，李艷菊

(1貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽 550001；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

衰老是一種慢性的炎癥狀態(tài)，是一種先天免疫被激活，并伴隨促炎癥細(xì)胞因子水平升高的現(xiàn)象。隨著年齡的增長，促炎癥反應(yīng)呈慢性進(jìn)行性增加，而血漿和細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子水平增加發(fā)揮著重要作用[1～3]。目前研究[4,5]表明，乙酰膽堿酯酶(AchE)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)代謝失調(diào)所致生化改變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老的重要因素之一。隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生率日益升高，迄今并沒有理想的防治手段，如何防治腦衰老已成為當(dāng)今生命科學(xué)和社會科學(xué)關(guān)注的重大課題。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎與腦關(guān)系密切，腦為髓海，腎藏精生髓充腦。衰老機(jī)體腎精不足，髓?？仗?，腦失其養(yǎng)，造成衰老相關(guān)腦病的發(fā)生。天門冬屬為百合科，又名天冬、明冬、絲冬等，是多年生草本或半灌木，全世界約有300種，我國有24種，自然分布于貴州、廣東、云南、四川等地，其中以貴州產(chǎn)量最大，品質(zhì)最佳。因貴州特殊的喀斯特地貌環(huán)境，天門冬作為重點(diǎn)發(fā)展的貴州傳統(tǒng)苗藥得以大力種植。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，天門冬具有固腎抗衰老、抗凋亡等作用[6,7]。本研究觀察了飲用苗藥天門冬水煎劑72周的SD雄性大鼠學(xué)習(xí)記憶、空間探索能力及血清炎癥因子水平、腦組織神經(jīng)酶活性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、儀器及試劑 天門冬購于貴陽仁濟(jì)堂；IL-1、IL-6、AchE、ChAT測試盒(南京建成生物工程研究所)；Morris水迷宮圖像自動采集和處理系統(tǒng)(中科院藥物研究所)；T5000Y型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠)；FA1204B分析天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)(湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；玻璃勻漿器；酶標(biāo)儀；洗板機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 3周齡SD雄性大鼠18只，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。將大鼠分為天門冬組、衰老組、對照組各6只，天門冬組大鼠自由飲用12 g/L的天門冬水煎劑72周(根據(jù)醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動物學(xué)[8]72周相當(dāng)于50～55歲，為大鼠老年期)，衰老組大鼠自由飲用自來水72周，對照組大鼠自由飲用自來水6周。飼養(yǎng)在室溫為18～22 ℃、相對濕度50%～60%、12 h晝夜交替的動物房內(nèi)。

1.3 大鼠一般情況觀察 飼養(yǎng)開始，每3天早上(8∶00～10∶00)用電子天平對大鼠進(jìn)行稱量，觀察大鼠狀態(tài)，并做記錄。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及空間探索能力評價(jià) 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及空間探索能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前7 d，采用Morris水迷宮圖像自動采集和處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)分為定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。①定位航行試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)過程中保持安靜及光線的一致，定位航行試驗(yàn)時(shí)將大鼠從不同象限入水點(diǎn)面向池壁放入水中，觀察大鼠自入水點(diǎn)找到平臺所需的時(shí)間(潛伏時(shí)間)和游泳距離。大鼠在90 s內(nèi)若沒有找到平臺，行人為將大鼠引到平臺上并停留15 s，此時(shí)的潛伏期計(jì)為90 s，電腦智能記錄大鼠成績，連續(xù)4 d。②空間探索實(shí)驗(yàn)：第5 d行空間探索實(shí)驗(yàn)(測試大鼠對原平臺的記憶)，撤除平臺，將各組大鼠從平臺對側(cè)象限放入水中，記錄其在90 s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)與在平臺所在象限停留時(shí)間。

1.5 大鼠血清炎癥因子檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(天門冬組、衰老組為72周，對照組為6周)，各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，股動脈取血處死，分離血清，分裝待用，采用酶聯(lián)免疫法檢測IL-1、IL-6，具體步驟嚴(yán)格按照試劑說明書要求操作。

1.6 大鼠腦組織AchE、ChAT活性檢測 大鼠處死后，精確稱取腦組織，勻漿，分離取上清液，待用。采用酶聯(lián)免疫法檢測AchE、ChAT，具體步驟嚴(yán)格按照試劑說明書要求操作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般體征比較 對照組大鼠精神狀態(tài)好，好動活躍，毛色光澤。隨著時(shí)間延長，衰老組大鼠出現(xiàn)體格肥胖，精神萎靡，活動明顯降低，常處于睡眠狀態(tài)，毛色無光色泛黃。天門冬組大鼠在精神和活動狀態(tài)上稍微好于衰老組。

2.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1～4天潛伏時(shí)間比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1～4天潛伏時(shí)間比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰老組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1～4天游泳距離比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1～4天游泳距離比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第5天首次穿越平臺時(shí)間、穿越平臺次數(shù)、穿越平臺區(qū)時(shí)間比較 結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第5天首次穿越平臺時(shí)間、穿越平臺次數(shù)、穿越平臺區(qū)時(shí)間比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰老組比較，#P<0.05。

2.5 各組大鼠血清IL-1、IL-6水平比較 結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清IL-1、IL-6水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰老組比較，#P<0.05。

2.6 各組大鼠腦組織AchE、ChAT活性比較 結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠腦組織AchE、ChAT活性比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與衰老組比較，#P<0.05。

3 討論

天門冬在我國已有幾千年的藥用歷史，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，是貴州民族苗醫(yī)藥重要組成部分。天門冬塊根營養(yǎng)成分豐富，富含多種人體必需氨基酸以及甾醇、糖類等成分，其藥理主歸肺、腎二經(jīng)，具有清肺、降火、滋陰、潤燥和止咳等功效[9]。研究[10]認(rèn)為，貴州產(chǎn)天門冬遺傳多樣性較大，可能是其道地產(chǎn)區(qū)，且貴州產(chǎn)天門冬效果好于全國其他地方。有關(guān)天門冬研究報(bào)道其藥效可抗機(jī)體衰老、抗感染消炎及抗腫瘤作用[11]。文獻(xiàn)[12～15]報(bào)道，天門冬具有神經(jīng)保護(hù)作用，可明顯改善認(rèn)知學(xué)習(xí)能力，同時(shí)對早老性癡呆即阿爾茨海默病也具有防治作用。

學(xué)習(xí)記憶能力作為認(rèn)知功能的一部分，大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)人和動物的學(xué)習(xí)、記憶能力都存在隨年齡增長而衰退現(xiàn)象[16]。水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠空間認(rèn)知行為能力是評估大腦衰老的重要行為學(xué)依據(jù)，探討延緩腦衰老的機(jī)理，尋找有效的抗衰老藥物已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[17,18]。本研究顯示，與對照組比較，天門冬組和衰老組實(shí)驗(yàn)第1～4天潛伏時(shí)間長；與衰老組比較，天門冬組實(shí)驗(yàn)第4天潛伏時(shí)間短。與對照組比較，天門冬組和衰老組實(shí)驗(yàn)第2～4天游泳距離長。與對照組比較，天門冬組實(shí)驗(yàn)第5天首次穿越平臺時(shí)間長、穿越平臺次數(shù)少，衰老組實(shí)驗(yàn)第5天首次穿越平臺時(shí)間長、穿越平臺次數(shù)少、穿越平臺區(qū)時(shí)間短；與衰老組比較，天門冬組實(shí)驗(yàn)第5天首次穿越平臺時(shí)間短、穿越平臺次數(shù)多。提示給予天門冬可改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及空間操作能力。

衰老是一種機(jī)體慢性的、低程度的炎癥狀態(tài)，隨著年齡的逐漸增長，機(jī)體的各組織系統(tǒng)發(fā)生著復(fù)雜的變化，機(jī)體各種細(xì)胞因子也發(fā)生改變，特別是促炎細(xì)胞因子水平增加是引起衰老方式之一。目前，全球已進(jìn)入老齡化社會，如何延緩衰老成為研究熱點(diǎn)。本研究顯示，與對照組比較，天門冬組和衰老組血清IL-1、IL-6水平升高；與衰老組比較，天門冬組血清IL-1、IL-6水平降低。提示天門冬具有抗炎效果。

國內(nèi)外研究[19,20]發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)及大腦功能減退是衰老的重要原因。大腦中樞膽堿能系統(tǒng)是認(rèn)知行為學(xué)的主要調(diào)控單位，而大腦膽堿能具有代表性物質(zhì)ChAT、AchE活性與Ach水平關(guān)系密切。研究[21]證實(shí)，大腦膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，Ach是由膽堿能神經(jīng)末梢釋放的用于維持高級神經(jīng)功能的一種重要神經(jīng)介質(zhì)，Ach的量與ChAT、AchE活性有關(guān)，二者相輔相成共同維持腦內(nèi)Ach量的動態(tài)平衡。大量實(shí)驗(yàn)研究已將腦內(nèi)ChAT、AchE活性作為腦功能衰老研究的主要指標(biāo)，也作為腦衰老藥物治療機(jī)制靶點(diǎn)[22,23]。本研究顯示，與對照組比較，天門冬組和衰老組AchE活性增強(qiáng)，ChAT活性減弱；與衰老組比較，天門冬組AchE活性減弱，ChAT活性增強(qiáng)。提示天門冬具有改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿酶分泌的作用。

總之，苗藥天門冬可改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力及機(jī)體炎癥因子水平、腦組織神經(jīng)酶分泌。