腦膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ncRNA-LINC01116的表達(dá)變化及其意義

林樹楷，李鋼，周奮，劉仲海，隋建美

(1海南省第三人民醫(yī)院，海南三亞 572000；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其發(fā)病率與病死率均居中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之首[1]。腦膠質(zhì)瘤的組織學(xué)亞型眾多，一般可分為毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤、彌漫型星型細(xì)胞瘤、間變型少突星型細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，而WHO則依據(jù)其惡性程度將其劃分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)[2]。近年來(lái)，雖然外科手術(shù)、放療、化療、輔助治療等治療手段不斷拓展[3]，但腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不容樂觀[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組非蛋白質(zhì)編碼RNA的統(tǒng)稱，目前發(fā)現(xiàn)的lncRNA長(zhǎng)度為20～200個(gè)核苷酸[5]。lncRNA作為一大類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄干擾與染色質(zhì)重塑等途徑調(diào)控基因表達(dá)[6]，其中l(wèi)ncRNA-LINC01116已被證實(shí)在多種類型腫瘤中過(guò)表達(dá)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，若用siRNA抑制前列腺癌中l(wèi)ncRNA-LINC01116的表達(dá)，則腫瘤細(xì)胞的增殖與疾病的進(jìn)展都會(huì)受到抑制。但目前l(fā)ncRNA-LINC01116在腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中所起的作用尚未得到深入研究，因而也限制了其在臨床上應(yīng)用的拓展。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR法)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ncRNA-LINC01116，并分析其與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系，以求判斷將其作為腦膠質(zhì)瘤臨床病理診斷手段和評(píng)估患者預(yù)后指標(biāo)的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2005年3月～2010年9月海南省第三人民醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者95例，男56例，女39例；年齡21～68歲，其中≤45歲51例、>45歲44例；無(wú)腦積水91例，有腦積水4例；病理類型為星形細(xì)胞瘤46例，膠質(zhì)細(xì)胞瘤49例；腫瘤直徑<4 cm 34例，≥4 cm 61例；術(shù)前KPS評(píng)分≤70分23例，>70分63例；侵犯腦葉數(shù)<2個(gè)71例，≥2個(gè)24例；病理分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)38例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)57例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床資料完整，出院隨訪未失訪；②經(jīng)病理科確診為腦膠質(zhì)瘤；③為原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤；④未合并其他惡性腫瘤；⑤術(shù)前未經(jīng)放、化療等其他抗腫瘤手段治療；⑥未合并嚴(yán)重代謝性疾??；⑦術(shù)后存活期超過(guò)3個(gè)月，以排除手術(shù)原因造成的死亡。手術(shù)留取腦膠質(zhì)瘤組織95例份，另選同期經(jīng)顱內(nèi)減壓術(shù)切取的正常腦組織21例份作為對(duì)照。本研究經(jīng)本院倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)，且患者及家屬均知情同意。

1.2 組織中l(wèi)ncRNA-LINC01116檢測(cè)方法 采用qRT-PCR法。將待測(cè)樣本置于勻漿器中磨碎，加入TRIzol?試劑，充分裂解后加入氯仿，冰浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清，加入異丙醇沉淀后，75%乙醇洗滌沉淀，收集RNA沉淀，加入適量DEPC水重分溶解。利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA濃度，取OD260/OD280值在1.8～2.0的樣本。利用TaKaRa RR047A PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｒ訥ADPH為內(nèi)參，利用TaKaRa RR420A SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行qRT-PCR，以2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA-LINC01116的相對(duì)表達(dá)量。lncRNA-LINC01116上游引物序列：5′-CTTCTTTCCCTCCAAGTGAT-3′，下游引物序列：5′-TTAGCAAGTCAGCAAGTCCT-3′；GADPH上游引物序列：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物序列：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.3 患者預(yù)后隨訪 以患者術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，通過(guò)電話、電子通訊與復(fù)診相結(jié)合的手段對(duì)患者進(jìn)行隨訪。隨訪截止于2017年10月，隨訪時(shí)間10～127個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤、正常組織lncRNA-LINC01116表達(dá)比較 腦膠質(zhì)瘤、正常組織lncRNA-LINC01116的相對(duì)表達(dá)量分別為0.665±0.678、0.103±0.147，兩者比較，P<0.05。

2.2 lncRNA-LINC01116表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，lncRNA-LINC01116僅與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、是否發(fā)生腦積水、病理類型、腫瘤直徑、術(shù)前KPS評(píng)分、侵犯腦葉數(shù)目無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

2.3 lncRNA-LINC01116表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系 按照l(shuí)ncRNA-LINC01116相對(duì)表達(dá)量的平均數(shù)0.665為界，將95例患者分為低表達(dá)者41例和高表達(dá)者54例，繪制Kaplan-Meier生存曲線(見圖1)；低表達(dá)者生存率為73.17%(30/41)、生存時(shí)間為(100.30±6.91)個(gè)月，高表達(dá)者生存率為31.48%(17/54)、生存時(shí)間為(43.90±5.92)個(gè)月，兩者比較，P均<0.05；低表達(dá)者復(fù)發(fā)率為31.71%(13/41)，高表達(dá)者復(fù)發(fā)率為74.07%(40/54)，兩者比較，P<0.05。

表1 lncRNA-LINC01116表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 腦膠質(zhì)瘤患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

腦膠質(zhì)瘤屬于浸潤(rùn)性腫瘤，腫瘤細(xì)胞可向周圍正常組織滲透，與正常腦組織缺乏明確的分界，顯著增加了外科手術(shù)切除的難度，這是腦膠質(zhì)瘤患者生存率低、預(yù)后差的主要原因[8]。此外，腦膠質(zhì)瘤組織具有持續(xù)無(wú)限復(fù)制、血管快速生成以及免疫逃逸等特性，因而具有較強(qiáng)的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[9]。腦膠質(zhì)瘤是高度異質(zhì)性腫瘤，放化療藥物難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定位，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放化療具有高度耐受性[10]。因此，從基因與細(xì)胞層面上探究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，可為腦膠質(zhì)瘤患者的個(gè)體化治療提供方向。

近期，Gao等[11]利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)到lncRNA-HOXAAS2在腦膠質(zhì)瘤組織與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)均異常升高，抑制lncRNA-HOXAAS2表達(dá)后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力隨之減弱，且腦膠質(zhì)瘤組織的血管生成也受到抑制；Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PAR5通過(guò)影響EZH2基因表達(dá)，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移；lncRNA-MEG3則是通過(guò)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[13]。然而Dong等[14]卻發(fā)現(xiàn)，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-ANRIL表達(dá)，雖能減弱細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲能力，但同時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果表明，不同lncRNA可能通過(guò)影響不同基因、信號(hào)通路參與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲等過(guò)程。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類基因組中超過(guò)90%的基因被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA。lncRNA是指其中長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。lncRNA參與機(jī)體內(nèi)多種生理進(jìn)程，如表觀遺傳調(diào)控、RNA降解、miRNA沉默、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組織的構(gòu)建以及蛋白質(zhì)定位的調(diào)控等[15～17]。研究[18～20]表明，lncRNA異常表達(dá)與多種疾病相關(guān)，尤其是惡性腫瘤[21,22]。lncRNA-LINC01116是一段長(zhǎng)1 058 bp的基因，位于人體染色體2q31.1[23]。研究[24]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-LINC01116能夠參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的多種細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，從而參與缺氧相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。而惡性腫瘤相關(guān)研究則發(fā)現(xiàn)，lncRNA-LINC01116能夠通過(guò)影響YAP1、VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達(dá)，參與非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[25]。

本研究顯示，lncRNA-LINC01116在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，提示lncRNA-LINC01116可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤組織的形成與發(fā)展，與lncRNA-HOXAAS2、lncRNA-PAR5以及l(fā)ncRNA-MEG3等的作用類似，均呈現(xiàn)促癌基因作用。本文結(jié)果顯示，lncRNA-LINC01116表達(dá)僅與腦膠質(zhì)瘤患者病理分級(jí)相關(guān)，而與患者其他臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)。腦膠質(zhì)瘤是一種高度異質(zhì)性腫瘤，不同組織亞型的腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性相差較大，且由于本研究中的樣本數(shù)較少，導(dǎo)致并未發(fā)現(xiàn)lncRNA-LINC01116表達(dá)與患者年齡、性別、是否發(fā)生腦積水、病理類型、腫瘤大小、術(shù)前KPS評(píng)分以及侵犯腦葉數(shù)之間存在關(guān)聯(lián)。本研究還發(fā)現(xiàn)，lncRNA-LINC01116表達(dá)程度低的患者，具有較高的術(shù)后生存率、較長(zhǎng)的生存時(shí)間以及較低的復(fù)發(fā)率，提示lncRNA-LINC01116高表達(dá)可以作為腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的指標(biāo)之一。

總之，lncRNA-LINC01116在腦膠質(zhì)瘤組織中異常高表達(dá)，其高表達(dá)提示較高的復(fù)發(fā)概率以及較差的預(yù)后。因此對(duì)于高表達(dá)lncRNA-LINC01116的腦膠質(zhì)瘤患者，建議術(shù)后結(jié)合放療、化療等手段輔助治療，同時(shí)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，預(yù)防復(fù)發(fā)，提高患者生存率，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。