子癇前期患者血清及胎盤(pán)組織中VEGF和MMP-9的研究

王 書(shū)，張久梅

（1.白銀市白銀區(qū)人口和計(jì)劃生育服務(wù)站，甘肅 白銀 730900；2.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

子癇前期或稱(chēng)為先兆子癇，是妊娠期的特發(fā)性疾病，在我國(guó)的發(fā)病率為5%～8%[1]。其發(fā)病原因主要可能涉及以下幾個(gè)方面[2]：血管內(nèi)皮損傷、滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、免疫調(diào)節(jié)功能異常、遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)因素等。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性，能夠誘導(dǎo)新血管生長(zhǎng)[3]。血液中的VEGF與其受體結(jié)合，能夠激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶，繼而使下游細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)啟動(dòng)，從而促使新血管生長(zhǎng)[4]，它對(duì)著床、胎盤(pán)血管形成有重要意義?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一類(lèi)肽鏈內(nèi)切酶，又稱(chēng)明膠酶，主要由滋養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及結(jié)締組織細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞分泌[5]，其主要功能是保持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。鑒于上述二者如此重要的生理功能，本研究著力于分析其在孕婦胎盤(pán)組織中的表達(dá)，揭示二者與子癇前期發(fā)生的關(guān)系，造?；颊?。

1 材料

1.1 受試對(duì)象

選擇2013年1月至2014年12月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院進(jìn)行剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的子癇前期孕婦81例，其中輕度子癇前期41例（定義為輕度組），重度子癇前期40例（定義為重度組），另外選擇相同時(shí)期孕足月進(jìn)行剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的45例健康孕婦為對(duì)照組。按照全國(guó)統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版分類(lèi)和診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分類(lèi)。3組孕婦均為單胎，胎兒無(wú)畸形；孕婦既往均無(wú)嚴(yán)重病史、不良孕產(chǎn)史以及長(zhǎng)期服用藥物史，各組孕婦都排除內(nèi)科合并癥以及產(chǎn)科并發(fā)癥。

1.2 主要試劑及來(lái)源

VEGF酶聯(lián)免疫法試劑盒購(gòu)自上?？ㄅ锟萍加邢薰荆籑MP-9酶聯(lián)免疫法試劑盒購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司；免疫組化（SP法）染色試劑盒、鼠抗人VEGF單克隆抗體、山羊抗人MMP-9多克隆抗體均采購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 血清樣本的采集

采集孕婦分娩前清晨靜脈血，離心機(jī)2 000 r/min離心15分鐘，收集血清，于4℃保存，用于檢測(cè)，樣本在收集12小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 胎盤(pán)樣本的收集

剖宮產(chǎn)過(guò)程中孕婦胎盤(pán)娩出以后，在臍帶附著處取組織一塊（母體面），面積約1 cm×1 cm×1 cm，無(wú)出血鈣化，用pH為7.0的無(wú)菌PBS沖洗干凈，然后放置在4%的福爾馬林中，固定24小時(shí)以上，然后用石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片。所有樣本的獲得均取得受試對(duì)象與親屬的知情同意。

2.3 血清VEGF、MMP-9的檢測(cè)

采用VEGF、MMP-9酶聯(lián)免疫法試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 免疫組化測(cè)定方法

免疫組化的具體步驟[7]參照《病理學(xué)技術(shù)》及金橋生物SP法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果判定

在高倍顯微鏡下（400倍）觀察石蠟切片中細(xì)胞免疫染色情況，VEGF、MMP-9陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為顯微鏡下細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒，對(duì)每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，200個(gè)/視野。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Birner法[8]。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色的強(qiáng)度和細(xì)胞顯色的比例進(jìn)行半定量判定。按染色強(qiáng)度評(píng)分：染色無(wú)0分；染色弱1分；中等染色2分；強(qiáng)染色3分。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%得1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%得2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～80%得3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞80%得4分。兩種評(píng)分結(jié)果相加分為 4個(gè)等級(jí)：陰性（-）：0～1分；弱陽(yáng)性（+）：2～3分；中陽(yáng)性（＋＋）：4～5 分；強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）：6～7 分。

3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用kruskal-wallis H檢驗(yàn)、Mann-whitney檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，采用origin Pro 8.0作圖。

4 結(jié)果

4.1 一般資料比較

3組孕婦在年齡、孕周之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 1。

4.2 3組血清樣本中VEGF、MMP-9的檢測(cè)

表 1 3 組孕婦年齡、孕周比較（x±s）

3組血清樣本中VEGF與MMP-9的含量見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，輕度組與重度組的血清VEGF含量顯著性降低（P＜0.05），但輕度組與重度組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，輕度組與重度組的血清MMP-9含量顯著性降低（P＜0.05），重度組較輕度組的MMP-9含量顯著降低（P＜0.05）。

圖13組血清樣本中VEGF、MMP-9的含量

4.3 3組胎盤(pán)樣本中VEGF的表達(dá)

3組孕婦胎盤(pán)樣本中均有VEGF陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿是主要表達(dá)部位，此外，還有少量的VEGF在絨毛間質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)染色呈深黃色或黃褐色（見(jiàn)圖2）。VEGF在3組胎盤(pán)樣本中表達(dá)強(qiáng)度的比較見(jiàn)表2。表2顯示，對(duì)照組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率95.56%，輕度組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率73.17%，重度組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率37.50%。輕度組與對(duì)照組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-6.775，P＜0.05），重度組與對(duì)照組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.294，P＜0.05），重度組與輕度組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.291，P＜0.05）。

圖2 3組胎盤(pán)樣本中VEGF免疫組化結(jié)果

表2 3組胎盤(pán)樣本中VEGF的表達(dá)

4.4 3組胎盤(pán)樣本中MMP-9的表達(dá)

3組孕婦胎盤(pán)樣本中均有MMP-9陽(yáng)性表達(dá)，輕度組、重度組樣本中MMP-9定位與對(duì)照組相同，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞是主要表達(dá)部位，陽(yáng)性染色都呈現(xiàn)棕色、褐色（見(jiàn)圖3）。MMP-9在3組胎盤(pán)樣本中表達(dá)強(qiáng)度的比較見(jiàn)表3。表3顯示，對(duì)照組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率86.67%，輕度組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率65.85%，重度組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率37.50%。輕度組與對(duì)照組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.984，P＜0.05），重度組與對(duì)照組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.844，P＜0.05），重度組與輕度組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.437，P＜0.05）。

圖3 3組胎盤(pán)樣本中MMP-9免疫組化結(jié)果

表3 3組胎盤(pán)樣本中MMP-9的表達(dá)

4.5 樣本中VEGF與MMP-9的相關(guān)性研究

調(diào)查結(jié)果顯示：血清VEGF含量與胎盤(pán)VEGF表達(dá)的相關(guān)系數(shù)0.897，兩者呈正相關(guān)（P＜0.05）；血清MMP-9含量與胎盤(pán)MMP-9表達(dá)的相關(guān)系數(shù)1.000，兩者呈正相關(guān)（P＜0.05）；血清VEGF含量與血清MMP-9含量的相關(guān)系數(shù)0.922，兩者呈正相關(guān)（P＜0.05）；胎盤(pán)VEGF表達(dá)與胎盤(pán)MMP-9表達(dá)的相關(guān)系數(shù)0.999，兩者呈正相關(guān)（P＜0.05），具有見(jiàn)表 4。

表4VEGF與MMP-9的相關(guān)性

5 討論

5.1 血清、胎盤(pán)樣本中VEGF與子癇前期的關(guān)系

VEGF是一種功能強(qiáng)大且能產(chǎn)生多種效應(yīng)的細(xì)胞因子[9]，它具有誘導(dǎo)血管生成、提高血管的滲透性、改善血流動(dòng)力學(xué)功能等重要作用。本研究從血清學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)的角度研究VEGF的表達(dá)與子癇前期的關(guān)系。分析以上的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，子癇前期孕婦血清中的VEGF含量顯著降低，胎盤(pán)組織中VEGF的表達(dá)也顯著降低，并且隨著病情的加重，VEGF的表達(dá)降低越多。由此推測(cè)VEGF的低表達(dá)可能引起子癇前期的發(fā)生。在妊娠前期由于VEGF合成和釋放減少，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與分化，影響了胎盤(pán)血管的形成，最終造成子癇前期疾病的發(fā)生。另外血清VEGF含量與胎盤(pán)VEGF的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.01），由此提示在臨床應(yīng)用中可以通過(guò)檢測(cè)孕婦血清中的VEGF含量來(lái)預(yù)防子癇前期發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。目前，SFDA已經(jīng)有批準(zhǔn)文號(hào)的血清VEGF試劑盒（如威海威高VEGF試劑盒）應(yīng)用于臨床診斷，但是實(shí)際應(yīng)用主要針對(duì)腫瘤的檢測(cè)，依然沒(méi)有合理的參考水平范圍來(lái)定義子癇前期的發(fā)病，未來(lái)隨著研究的深入，相信這個(gè)問(wèn)題會(huì)得到解決。

5.2 血清、胎盤(pán)樣本中MMP-9與子癇前期的關(guān)系

MMP-9的生理作用廣泛，主要功能是保持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，例如胚胎發(fā)育、繁殖、血管和骨骼發(fā)育、傷口愈合、細(xì)胞遷移、學(xué)習(xí)、記憶以及在病理過(guò)程中的分解，如關(guān)節(jié)炎、腦出血以及癌細(xì)胞擴(kuò)散等。MMP-9可能在新血管形成中發(fā)揮重要作用，有顯著的證據(jù)[10]表明，MMP-9對(duì)血管生成的重要組分內(nèi)皮干細(xì)胞的形成有重要作用?；谝陨涎芯繑?shù)據(jù)顯示，與正常孕婦相比，子癇前期孕婦血清中的MMP-9顯著降低，胎盤(pán)組織中的MMP-9的表達(dá)也顯著降低，并且隨著病情的加重，MMP-9的降低更加明顯。由此推測(cè)：胎盤(pán)組織MMP-9的表達(dá)降低可能也是子癇前期發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)因素。在妊娠期，MMP-9的低表達(dá)使細(xì)胞外基質(zhì)降解與重塑功能減弱，使血管內(nèi)皮干細(xì)胞生成緩慢，進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與分化、血管的形成，最終造成子癇前期的發(fā)生。另外血清MMP-9含量與胎盤(pán)MMP-9的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），提示在臨床應(yīng)用中可以通過(guò)檢測(cè)孕婦血清中的MMP-9含量來(lái)預(yù)防子癇前期發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。目前血清MMP-9檢測(cè)試劑盒均為科研用途，依然沒(méi)有應(yīng)用于臨床診斷的MMP-9試劑盒。

5.3 VEGF與MMP-9的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是血清中VEGF與MMP-9的含量，還是胎盤(pán)組織中VEGF與MMP-9的表達(dá)，均存在正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），這與黃建超[11]的研究MMP-9可通過(guò)釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）以參與血管生成具有一致性。

綜上所述，基于VEGF、MMP-9血清學(xué)的檢測(cè)以及在胎盤(pán)組織中的定位表達(dá)，說(shuō)明二者均參與了正常妊娠生理過(guò)程，二者的低表達(dá)可能引起孕婦子癇前期的發(fā)生。