意大利生菜轉(zhuǎn)化體系建立及EV71抗原基因表達初探

羅 雯,張同林,艾佐佐,劉艷梅,劉旺喜

(南昌師范學(xué)院生物系,中國江西南昌 330032)

由于農(nóng)作物易于轉(zhuǎn)化,可提供廉價的蛋白質(zhì)源,所以農(nóng)作物作為植物反應(yīng)器生產(chǎn)生物產(chǎn)品的研究與應(yīng)用,受到越來越多的科研機構(gòu)和商業(yè)公司的關(guān)注。然而,在研究過程中尚有許多問題有待解決:煙草組織中含有大量的生物堿[1],不宜作為口服疫苗,且從煙草中分離純化目的蛋白的成本較高[2];馬鈴薯雖是比較理想的轉(zhuǎn)化試材,但不適合生食;番茄為可生食蔬菜,但果實成熟后易腐爛;用胡蘿卜制備肺結(jié)核疫苗時,抗原在種子中含量較高,但在可食用的塊根中含量卻很低[3,4]。

生菜(Lactuca sativa L.var.ramosa Hort.)正好規(guī)避了上述缺點。生菜為菊科(Asteraceae)萵苣屬(Lactuca)下的一個變種,富含維生素C和多種礦質(zhì)元素,是一種食用價值較高的蔬菜類群;同時,該類群具有易繁殖、生長周期短、適宜栽培地廣、栽種條件簡單等特性;而且,重組蛋白在該類群葉片中可被穩(wěn)定表達,不需要高溫處理即可通過消化途徑被人體或動物機體有效吸收,種子可長期保存[5～7]。因此,生菜已作為植物生物反應(yīng)器被應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因工程中。

生菜離體再生的成功報道首見于1967年,成功轉(zhuǎn)基因于1987年實現(xiàn)[8],目前該研究主要集中于生菜子葉離體轉(zhuǎn)化再生的條件以及導(dǎo)入外源基因的表達探索。鄧小莉等[9]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將融合基因O21-O14-A21-HBcAg轉(zhuǎn)入美國大速生生菜,并成功地整合到生菜基因組中,為口蹄疫疫苗的制備提供了研究資料。敬軍等[10]利用生菜成功構(gòu)建了含有g(shù)ap-gp120基因的轉(zhuǎn)基因植株,并證明外源基因已整合到北京生菜基因組中。年洪娟等[11]將胸腺肽基因?qū)氪笏偕?為胸腺肽的生產(chǎn)提供了一條經(jīng)濟有效的新途徑。同樣以大速生為試材,中國研究者還構(gòu)建獲得了轉(zhuǎn)基因防齲生菜,并已驗證了T3、T4代轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定性[12,13]。

意大利生菜是生菜的一個培養(yǎng)品種,相對其他基因型,該作物品種更有生長周期短、一年四季可收獲的優(yōu)勢[14]。這些特性使意大利生菜在口服疫苗等外源蛋白質(zhì)的表達方面更具有獨特的優(yōu)勢。因此本研究在前期工作基礎(chǔ)上,進一步分析了在添加合適的抗生素后,誘導(dǎo)抗性愈傷組織和抗性芽分化的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑濃度;并利用此轉(zhuǎn)化體系初步探索了在生菜中共表達腸道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)P1和3CD基因的可行性。

EV71是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)內(nèi)的無包膜單鏈RNA病毒,病毒基因組由含有P1、P2和P3區(qū)的單個開放閱讀框組成。P2和P3區(qū)域編碼負責(zé)病毒復(fù)制和毒力的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(例如3CD),而P1區(qū)域編碼P1前體,可被3CD蛋白酶切割成VP0、VP1和VP3,這3種蛋白質(zhì)自發(fā)地組裝成二十面體衣殼,包裹RNA基因[15],完成病毒裝配。體外表達的P1前體也可被3CD蛋白酶切割,并自發(fā)組裝成二十面體衣殼,形成病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)。VLP不含病毒核酸,但引起的免疫應(yīng)答強度與真實病毒刺激的差異很小,是較理想的一種疫苗形式。相比微生物和動物生物反應(yīng)器,利用植物生產(chǎn)的口服疫苗優(yōu)勢明顯,如低成本、良好的安全性、貯存和運輸便利、可有效刺激黏膜免疫應(yīng)答等[16,17]。因此,利用植物轉(zhuǎn)基因制備EV71 VLP有望提供一條更加經(jīng)濟、有效、安全地制備EV71新型疫苗的新途徑。本研究為進一步研制基于EV71 VLP的手足口病新型口服疫苗提供了重要的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 菌種及質(zhì)粒

對照植物基因偏性密碼子優(yōu)化GenBank中的EV71 P1基因(GenBank:EU812515.1),同時參照GenBank中的EV71 3CD基因序列(GenBank:EU812515.1),設(shè)計合成EV71 P1基因和3CD基因,分別克隆入植物表達載體pCAMBIA2301,構(gòu)建重組雙元植物表達載體pCAMBIA2301-P1-3CD(結(jié)果待發(fā)表)。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑

抗生素:利福平(rifampicin,Rif)、卡那霉素(kanamycin,)、羧芐青霉素(carbenicillin,Carb)、頭孢霉素(cefotaxime,Cef)、安美汀(augmentin,Aug)等,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

植物生長調(diào)節(jié)劑:6-芐基腺嘌呤 (6-benzylaminopurine,6-BA)、萘乙酸(naphthylacetic acid,NAA),均為國產(chǎn)分析純。

1.2 意大利生菜子葉轉(zhuǎn)化體系選擇劑濃度篩選

以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加濃度為0.5 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的NAA作為意大利生菜子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基[14],在此培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加Kan配制選擇培養(yǎng)基,Kan濃度設(shè)為0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、150 mg/L。于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察愈傷分化情況。實驗重復(fù)3次。

1.3 意大利生菜子葉轉(zhuǎn)化體系最佳抑菌劑的選擇

在確定了適宜Kan濃度之后,于上述選擇培養(yǎng)基中添加不同抑菌劑,分別為Carb:0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L;Cef:0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L;Aug:0 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L。用pCAMBIA2301-P1-3CD凍融法[18]轉(zhuǎn)化LBA4404,即液氮速凍5 min后28℃溫浴5 min,28℃復(fù)蘇5 h后選擇培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌菌液浸染生菜無菌苗子葉,共培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入添加抑菌劑的選擇培養(yǎng)基,25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察愈傷分化情況。實驗重復(fù)3次。

1.4 抗性愈傷組織誘導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度篩選

用重組農(nóng)桿菌LBA4404浸染轉(zhuǎn)化無菌意大利生菜子葉,共培養(yǎng)3 d后,轉(zhuǎn)接至以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加有選擇劑Kan(50 mg/L)和抑菌劑Carb(400 mg/L),同時含有不同濃度6-BA與NAA的篩選培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導(dǎo)。觀察子葉愈傷組織的生長狀況以確定抗生素對最佳誘導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的影響。實驗設(shè)6-BA濃度0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L,NAA 濃度 0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.15 mg/L、0.2 mg/L,進行全面實驗,重復(fù)3次。

1.5 抗性植株的選擇培養(yǎng)

將愈傷組織誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基上生長良好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加有Kan 50 mg/L和Carb 400 mg/L的MS培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中附加0.25 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA,進行芽的誘導(dǎo)[14]。培養(yǎng)4周后,將長勢良好的抗性芽轉(zhuǎn)接入添加Kan 50 mg/L和Carb 400 mg/L的MS培養(yǎng)基,誘導(dǎo)生根。

1.6 轉(zhuǎn)化植株的DNA鑒定

參照崔學(xué)強等[19]的研究方法,適當(dāng)改良,直接取抗性植株葉片進行PCR檢測。切取數(shù)個約2 mm2的葉片,放入含 200 μL 0.3 mol/L NaOH的 Eppendorf管中,于沸水煮30 s后取出,添加200 μL 0.3 mol/L HCl和 100 μL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0),再次于沸水中煮3 min,挑取經(jīng)此法處理的一小片葉片作為PCR模板。參照EV71 P1和3CD基因序列設(shè)計擴增引物,分別為3CD-F:5′-CTGTTGGAAAGGTTATCGG-3′,3CD-R:5′-TAGACCAGAATGTGTCAGG-3′,P1-F:5′-AGAGTATGTTATTGGAACAGTG-3′,P1-R:5′-GCAATGAGCATCTTTCCAG-3′。PCR退火溫度為55℃。以pCAMBIA2301-P1-3CD質(zhì)粒為模板,設(shè)置PCR擴增陽性對照;以未轉(zhuǎn)化生菜葉片為模板,設(shè)置陰性對照;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.7 轉(zhuǎn)化植株葉片的Western-blot分析

參照文獻的方法[20]提取總蛋白質(zhì),并檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的活性,蛋白質(zhì)提取緩沖液為0.2 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)。取 0.1 g葉片,加入 50 μL 提取液,冰浴研磨后,10 000 r/min離心10 min,取上清重復(fù)離心1次。取制備的總蛋白質(zhì)提取液15 μL進行SDS-PAGE和Western-blot分析,操作步驟參照生工生物工程(上海)股份有限公司W(wǎng)esternblot試劑盒(No.C620392)使用說明,經(jīng)封閉液封閉后,與兔抗EV71 VP1多克隆抗體(生工生物工程(上海)股份有限公司制備)溶液共同孵育,最后與HRP標(biāo)記的二抗(試劑盒提供)共同孵育1 h,DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 最佳選擇壓力和抑菌劑的確定

生菜子葉在含有不同Kan濃度的愈傷誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上,光照培養(yǎng)4周,愈傷分化情況見表1。在添加有50 mg/L Kan的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,外植體全部枯死(圖1),因此該濃度為較嚴(yán)格的篩選濃度。

確定選擇壓為Kan 50 mg/L后,進一步分析Cef、Carb或Aug作為抑菌劑的效果。光照培養(yǎng)4周后,不同質(zhì)量濃度的抗生素對生菜子葉愈傷分化的影響以及對農(nóng)桿菌的抑制效果見圖2和表2。Carb濃度達到400 mg/L,農(nóng)桿菌才能被有效抑制,此時外植體有明顯愈傷分化。Aug濃度達到400 mg/L,農(nóng)桿菌亦可被抑制,但是在濃度達到1 g/L后,才有愈傷分化的跡象,而且效果不如添加400 mg/L Carb的培養(yǎng)基。Cef雖然在200 mg/L即可抑制農(nóng)桿菌生長,但在本實驗設(shè)置的各濃度條件下,均未見生菜子葉有愈傷分化跡象。據(jù)此,確定抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基中抑菌劑為Carb,質(zhì)量濃度以400 mg/L為宜。

圖1 不同Kan濃度下意大利生菜子葉愈傷分化效果Fig.1 Callus differentiation of Italian lettuce cotyledons under different Kan concentrations

2.2 抗生素對愈傷組織誘導(dǎo)所需植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的影響

雖然在添加合適的選擇劑和抑菌劑后,轉(zhuǎn)化的生菜子葉有愈傷分化,但愈傷組織長勢不良,且不能在下一步實驗中誘導(dǎo)成芽。因此,在添加選擇劑Kan(50 mg/L)和抑菌劑Carb(400 mg/L)后,對愈傷組織誘導(dǎo)所需的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度進行了重新篩選,結(jié)果見表3。生菜子葉抗性愈傷誘導(dǎo)效果最佳濃度組合為0.4 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA和0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。在后續(xù)生芽誘導(dǎo)試驗中,源自6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L的抗性愈傷組織分化成芽的效果更佳。

圖2 添加不同抑菌劑后意大利生菜子葉愈傷分化效果Fig.2 Callus differentiation of Italian lettuce cotyledons under different antibacterial agents

2.3 EV71抗原基因轉(zhuǎn)化植株的分析鑒定

取誘導(dǎo)生根的抗性植株葉片,PCR檢測EV71 P1和3CD抗原基因是否成功導(dǎo)入意大利生菜。根據(jù)P1優(yōu)化基因序列設(shè)計的引物,擴增產(chǎn)物約770 bp;根據(jù)3CD基因序列設(shè)計的引物,擴增產(chǎn)物約750 bp。經(jīng)與pCAMBIA2301-P1-3CD質(zhì)粒為模板的陽性對照擴增結(jié)果比對,檢測結(jié)果表明在兩株篩選獲得的抗性植株中成功檢出了EV71 P1和3CD基因(圖3)。

表1 Kan濃度對意大利生菜子葉愈傷分化的影響Table 1 Effect of Kan concentration on callus differentiation of Italian lettuce cotyledons

表3 意大利生菜子葉抗性愈傷組織誘導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的篩選Table 3 Selection of plant hormone concentration for resistant callus differentiation of Italian lettuce cotyledons

圖3 轉(zhuǎn)基因抗性植株葉片PCR分析Fig.3 Leaf PCR analysis of resistant plants

提取葉片總蛋白質(zhì),對這兩株抗性植株進一步檢測,蛋白質(zhì)粗提液的Western-blot結(jié)果表明,其總蛋白質(zhì)提取物可以和兔抗EV71 VP1抗體結(jié)合,酶標(biāo)二抗結(jié)合后有顯色反應(yīng),特異性結(jié)合條帶在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)34 kD和43 kD之間;而未轉(zhuǎn)化的生菜葉片提取物和空載體pCAMBIA2301轉(zhuǎn)化的葉片提取物,均不能和兔抗EV71 VP1抗體結(jié)合,Western-blot檢測不顯色(圖 4)。

3 討論

本實驗室前期研究結(jié)果顯示,意大利生菜子葉愈傷組織誘導(dǎo)最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為0.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA[14]。但在本研究中,添加合適的選擇劑50 mg/L Kan和抑菌劑400 mg/L Carb后,通過葉盤法轉(zhuǎn)化的生菜子葉卻不能在此組合濃度下有效分化產(chǎn)生愈傷組織,推測抗生素的添加可能對愈傷誘導(dǎo)所需植物生長調(diào)節(jié)劑的量產(chǎn)生了影響。在對6-BA和NAA濃度進行重新組合篩選后,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后的意大利生菜愈傷組織誘導(dǎo)有效植物生長調(diào)節(jié)劑濃度明顯降低,最佳濃度組合為0.4 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA或0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,該結(jié)果說明抗生素對誘導(dǎo)生菜愈傷組織發(fā)生的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度影響較大。有研究認為,青霉素類抗生素在植物生長中有類似于植物生長調(diào)節(jié)劑的作用[21,22],推測這是導(dǎo)致外植體愈傷分化所需最佳植物生長調(diào)節(jié)劑濃度下降的主要原因。

圖4 遺傳轉(zhuǎn)化生菜葉片的Western-blot分析Fig.4 Western-blot analysis of genetically transformed leaves of lettuce

EV71是手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的主要病原體之一,C4型是中國主要流行基因型[23]。在EV71預(yù)防性疫苗研究中,滅活疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗、表位肽疫苗、亞單位疫苗和病毒樣顆粒疫苗是主要的研究方向[24]。VLP是由病毒衣殼蛋白質(zhì)組裝成的空顆粒,沒有病毒核酸,因此可以降低潛在的副作用。同時,病毒抗原和VLP表面上的表位的重復(fù)、高密度展示通常引起強烈的免疫應(yīng)答,與真實病毒刺激的差異很小,是目前較為理想的一種疫苗研究形式。EV71病毒基因組中,P1區(qū)域編碼P1前體,可被3CD蛋白酶切割成VP0、VP1和VP3,這3種蛋白質(zhì)自發(fā)地組裝成二十面體衣殼。目前,已有多個研究團隊利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)成功制備了EV71 VLP,初期研究結(jié)果表明,共表達P1和3CD裝配獲得的VLP明顯多于共感染分別表達P1和3CD的桿狀病毒[25];此后的EV71 VLP表達研究多采用這種共表達策略,都獲得了預(yù)期表達產(chǎn)物[26～28]。動物實驗表明,接種異源表達的EV71 VLP可刺激產(chǎn)生中和抗體[29～31];顯著抑制病毒在多種組織中的增殖[32]。各項研究充分證明了EV71 VLP作為疫苗備選的可行性,但嚴(yán)格的培養(yǎng)條件和表達量低成為制約利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)EV71 VLP的重要瓶頸[33]。相比之下,植物生物反應(yīng)器低成本、高安全性、易貯存等優(yōu)點,使得利用植物轉(zhuǎn)基因制備EV71 VLP有望提供一條更加經(jīng)濟、有效、安全地制備EV71新型疫苗的新途徑。

基于此,本研究借助前期構(gòu)建的EV71 P1和3CD兩個基因的雙元植物表達載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化意大利生菜子葉,獲得了轉(zhuǎn)基因抗性植株。對葉片PCR檢測陽性植株的表達產(chǎn)物進一步開展Western-blot分析,結(jié)果顯示,表達產(chǎn)物中可特異性結(jié)合EV71 VP1抗體的蛋白質(zhì)介于34 kD和43 kD之間,與文獻報道的VP1(39 kD)大小[34,35]相近。雖然Western-blot結(jié)果中,遺傳轉(zhuǎn)化株的泳道均出現(xiàn)了相似的非VP1大小蛋白質(zhì)條帶,但實驗中陰性對照始終沒有任何可結(jié)合蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn),推測為前體蛋白質(zhì)未切割或不完全切割所致,并非生菜葉片固有蛋白質(zhì)。在多個系統(tǒng)中的表達研究均顯示,當(dāng)P1前體被3CD蛋白酶正確切割后即可成功裝配出VLP,研究多以VP1的檢出為評價指標(biāo)[25,26,34,35]。因此推斷,EV71 P1和3CD基因在生菜葉片中同步表達,3CD蛋白酶可將P1前體正確切割,具備包裝產(chǎn)生VLP的可能性,且蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物具有生物學(xué)活性。

下一步,本實驗室將在大量獲得轉(zhuǎn)基因植株葉片的基礎(chǔ)上,提取純化相關(guān)大小的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,進一步開展EV71 VLP的電鏡檢測和免疫學(xué)實驗,對VLP裝配效率和表達產(chǎn)物的免疫活性作出評價,為研制基于EV71 VLP的手足口病新型口服疫苗提供充足的理論和實踐依據(jù)。