3種前處理方法處理嬰幼兒配方奶粉中二十二碳六烯酸、花生四烯酸、亞油酸和α-亞麻酸的差異性

李 潔, 鞠 香, 王艷麗, 田其燕, 申中蘭, 胡 梅, 劉艷明, 祝建華

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250101)

脂肪酸(fatty acid)是具有長烴鏈的羧酸,根據(jù)碳?xì)滏滐柡统潭瓤梢苑譃轱柡椭舅?SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)3大類。人體能自身合成所需的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸,但是含有2個(gè)或2個(gè)以上雙鍵的多不飽和脂肪酸則只能從植物中獲得,故后者稱為必需脂肪酸。多不飽和脂肪酸具有良好的生理功能,其中二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)對(duì)于人體的組織器官發(fā)育具有重要作用,尤其是對(duì)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有著不可替代的作用;亞油酸(C18∶2n6c)和α-亞麻酸(C18∶3n3)可以降低血中的膽固醇,調(diào)節(jié)心臟功能,改善血液微循環(huán),增強(qiáng)人體防御系統(tǒng)等[1-4]。亞油酸和α-亞麻酸在酶的催化作用下可轉(zhuǎn)化為DHA和ARA,從而被人體吸收[5]。在嬰幼兒配方奶粉中,多不飽和脂肪酸是重要的營養(yǎng)成分,以甘油酯的形式存在,由一分子甘油和三分子脂肪酸組成。甘油酯的結(jié)構(gòu)式見圖1, R端是含有多個(gè)雙鍵的碳?xì)滏?。衛(wèi)生部發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)[6,7]規(guī)定嬰幼兒配方奶粉中DHA、ARA、亞油酸和α-亞麻酸的添加量有非常嚴(yán)格的要求,因此準(zhǔn)確測定嬰幼兒配方奶粉中的脂肪酸含量十分必要。

圖 1 甘油酯的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of glyceride

由于DHA、ARA、亞油酸和α-亞麻酸的高度不飽和性,對(duì)空氣中的光照、氧氣、金屬離子等比較敏感[8-10],容易發(fā)生氧化、分解等,使其失去原有的營養(yǎng)價(jià)值。隨著食品工業(yè)的發(fā)展,奶粉生產(chǎn)廠家利用微膠囊技術(shù),將DHA、ARA等多不飽和脂肪酸包埋,形成微米級(jí)或納米級(jí)微膠囊[4,11-13],以提高其穩(wěn)定性。包埋技術(shù)的應(yīng)用使得脂肪酸在微膠囊中不容易

游離出來,尤其是含量較低的DHA和ARA,不能準(zhǔn)確測定。因此隨著包埋技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)檢測技術(shù)的要求也越來越高。測定嬰幼兒配方奶粉中DHA、ARA、亞油酸和α-亞麻酸含量的常用方法有氣相色譜法;常用的前處理方法有酸水解酯化法[14,15]、堿水解酯化法[16-18]和乙酰氯-甲醇甲酯化法[1,19]。3種前處理手段的差異性和反應(yīng)機(jī)理的研究也鮮有報(bào)道。本文研究了乙酰氯-甲醇甲酯化法、酸水解酯化法、堿水解酯化法3種前處理方法在測定嬰幼兒配方奶粉中脂肪酸含量的差異性,通過研究反應(yīng)過程,建立了準(zhǔn)確測定嬰幼兒配方奶粉中脂肪酸含量的氣相色譜法,尤其對(duì)于DHA、ARA等包埋的多不飽和脂肪酸,定量更加準(zhǔn)確可信。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B氣相色譜儀、SepulcoSPTM-2560毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm)(美國安捷倫公司); BT125D、TE214S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司); RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司); 20 mL帶螺紋蓋水解管(美國CNW公司);電熱恒溫水浴鍋(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

甲醇、甲苯、正庚烷(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司); 15%(體積分?jǐn)?shù))三氟化硼甲醇溶液(美國CNW公司);焦性沒食子酸、乙酰氯、乙醚和石油醚均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DHA甘油三酯、ARA甘油三酯、亞油酸甘油三酯、α-亞麻酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99% ,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。嬰幼兒配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)(美國NIST公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取1 000 mg亞油酸甘油三酯、α-亞麻酸甘油三酯、DHA甘油三酯、ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品,用甲苯定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1乙酰氯-甲醇甲酯化法

樣品處理過程參照標(biāo)準(zhǔn)方法[20]第二法進(jìn)行操作。準(zhǔn)確稱取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g(精確到0.1 mg),置于15 mL干燥螺口玻璃管中,加入5.0 mL甲苯和6.0 mL含10% (v/v)乙酰氯的甲醇溶液,振蕩混合,于(80±1) ℃水浴中衍生化2 h,然后冷卻至室溫。將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次,合并碳酸鈉溶液,置于50 mL離心管中,混勻,以5 000 r/min離心5 min,移取上清液,進(jìn)樣分析。

圖 2 不同前處理方法的過程示意圖Fig. 2 Process diagrams of the three pretreatment methodsM1: acetyl chlorocarbinol esterification; M2: acid hydrolysis esterification; M3: alkali hydrolysis esterification.

1.3.2提取脂肪酯化法

參照標(biāo)準(zhǔn)方法[20]第一法的酸水解法和堿水解法進(jìn)行脂肪的提取及甲酯化。準(zhǔn)確稱取乳粉試樣0.5 g(精確到0.1 mg),置于150 mL三角瓶中,加入約100 mg焦性沒食子酸,然后加入10 mL鹽酸溶液(酸水解酯化法)或5 mL氨水(堿水解酯化法),于70～80 ℃水浴中水解40～50 min,然后冷卻至室溫,用乙醚-石油醚重復(fù)提取水解液3次,合并有機(jī)相至旋蒸瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,殘留物為脂肪提取物。在脂肪提取物中加入含0.16 g氫氧化鈉的甲醇溶液8 mL,于(80±1) ℃水浴中回流,直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液繼續(xù)回流2 min,然后取出旋蒸瓶,冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入10 mL正庚烷,振搖2 min,再加入飽和氯化鈉水溶液,靜置分層,移取上層溶液,進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件

毛細(xì)管柱:SepulcoSPTM-2560毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:240 ℃;分流比:50∶1;柱流量:1 mL/min。升溫程序:初始溫度70 ℃,保持2 min;以15 ℃/min升溫至150 ℃,保持15 min;以2 ℃/min升溫至220 ℃,保持10 min;以20 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。進(jìn)樣體積:1 μL;檢測器:FID;檢測器溫度:250 ℃;氫氣流量:30 mL/min;空氣流量:300 mL/min;尾吹流量:30 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酸的檢測過程

脂肪酸并不是以游離態(tài)存在于嬰幼兒配方奶粉中,而是以脂肪的形式被蛋白質(zhì)和碳水化合物等包裹形成脂肪球,如果要測定脂肪酸的含量,需要破壞微膠囊壁材,將包埋的脂肪釋放出來,然后用有機(jī)溶劑提取,再進(jìn)行甲酯化,最后進(jìn)行氣相色譜檢測,具體過程見圖2。

如圖2所示,M1過程為乙酰氯-甲醇甲酯化法的過程示意圖,由于整個(gè)反應(yīng)是在密閉環(huán)境下進(jìn)行,微膠囊壁的破壞和油脂的甲酯化是同時(shí)進(jìn)行的,因此影響測定結(jié)果的主要因素是微膠囊壁的破壞率(水解效率)和甲酯化效率。M2和M3過程分別為酸水解酯化法和堿水解酯化法的過程示意圖,可以看出,水解效率、油脂的提取效率及甲酯化效率是影響酸、堿水解酯化法的3個(gè)要素。

2.2 乙酰氯-甲醇甲酯化法過程研究

乙酰氯-甲醇溶液可以釋放鹽酸,促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行[21,22];強(qiáng)酸在非水溶液中具有很強(qiáng)的破壞性,可以溶解非脂成分(蛋白質(zhì)、磷脂和碳水化合物等)使得微膠囊壁材被破壞,從而游離出脂肪。反應(yīng)是在密閉環(huán)境中進(jìn)行的,脂肪的水解與甲酯化是同時(shí)進(jìn)行的,即由一分子甘油與三分子脂肪酸組成的羧酸酯與甲醇進(jìn)行酯交換[23],酯交換反應(yīng)是可逆反應(yīng),因此將生成的甘油消耗掉可以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。乙酰氯-甲醇體系中的乙酰氯是較強(qiáng)的親核試劑,與甘油發(fā)生加成消除反應(yīng)[23],不僅消耗了甘油促進(jìn)酯交換的進(jìn)行,同時(shí)生成的鹽酸可進(jìn)一步破壞微膠囊壁材,使反應(yīng)相互循環(huán)促進(jìn)。因此乙酰氯-甲醇甲酯化法可使脂肪反應(yīng)更徹底,測定結(jié)果也更準(zhǔn)確。

在乙酰氯-甲醇甲酯化的體系中分別添加20、200和1 000 mg/100 g 3個(gè)水平的DHA甘油三酯、ARA甘油三酯、亞油酸甘油三酯、α-亞麻酸甘油三酯,4種脂肪酸在3個(gè)不同加標(biāo)水平下的回收率均在95% ～102%范圍內(nèi),進(jìn)一步驗(yàn)證了乙酰氯-甲醇甲酯化法的準(zhǔn)確性。

2.3 酸、堿水解酯化法過程研究

2.3.1水解效率的考察

微膠囊的外殼成分通常為大分子化合物,如乳糖、β-環(huán)糊精、酪蛋白、乳清蛋白等[4,11-13],這些化合物在強(qiáng)酸條件下比在堿性條件下水解程度高,而β-環(huán)糊精在堿性條件下穩(wěn)定存在,不會(huì)產(chǎn)生水解,脂肪酸也不會(huì)游離出來。因此酸堿環(huán)境對(duì)微膠囊壁的破壞程度有很大影響,脂肪的釋放效率也不同,即水解效率有所差異。

表 2 4種脂肪酸的提取效率Table 2 Extraction efficiencies of the four fatty acids

實(shí)驗(yàn)考察了酸、堿水解酯化法測定嬰幼兒配方奶粉中DHA、ARA、α-亞麻酸、亞油酸4種不飽和脂肪酸時(shí)的水解效率(見圖3)。結(jié)果表明,堿水解酯化的水解效率約為酸水解酯化的80% 。因此水解效率是影響酸、堿水解酯化法差異性的重要因素,酸水解酯化法使包埋的脂肪更徹底地釋放,更適合于嬰幼兒配方奶粉中脂肪的測定,此結(jié)論與GB 5009.168-2016標(biāo)準(zhǔn)中利用堿水解法對(duì)乳粉及液態(tài)乳等試樣進(jìn)行水解的描述存在差異。

圖 3 酸、堿水解酯化法測定4種不飽和脂肪酸時(shí)的水解效率Fig. 3 Hydrolysis efficiencies of the four unsaturated fatty acids by acid and alkali hydrolysis esterification methods DHA: docosahexaenoic acid; ARA: eicosatetraenoic acid; C18∶3n3: α-linolenic acid; C18∶2n6c: linoleic acid.

2.3.2甲酯化效率的考察

在空白油脂中分別加入20、200、1 000 mg/100 g 3個(gè)水平的DHA、ARA、α-亞麻酸、亞油酸的甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3.2節(jié)描述進(jìn)行甲酯化,考察甲酯化效率對(duì)測定結(jié)果的影響,結(jié)果見表1?？梢钥闯?4種脂肪酸在3個(gè)加標(biāo)水平下甲酯化效率為92.3%～96.9% 。由此可知,油脂的甲酯化效率較高,因此甲酯化效率并不是影響測定結(jié)果的主要因素。

表 1 4種脂肪酸的甲酯化效率Table 1 Methylation efficiencies of the four fatty acids

2.3.3提取效率的考察

在酸、堿水解液中分別加入20、200、1 000 mg/100 g 3個(gè)水平的DHA、ARA、α-亞麻酸、亞油酸的甘油三酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙醚石油醚對(duì)溶液進(jìn)行脂肪提取,提取效率見表2。

從表2可以看出,4種脂肪酸在酸、堿水解液中的提取回收率分別為98.1% ～99.2%和98.3% ～99.3% ,并沒有顯著差異,且提取效率較高,因此提取步驟并不是影響酸、堿水解差異性的關(guān)鍵因素,進(jìn)一步說明了水解效率是酸堿水解結(jié)果差異性的根本影響因素。

2.4 實(shí)際樣品的檢測

對(duì)同一嬰幼兒配方乳粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)(已知各脂肪酸含量)分別采用乙酰氯-甲醇甲酯化法、酸水解酯化法、堿水解酯化法進(jìn)行前處理,在相同的色譜條件下測定,獲得的色譜圖見圖4。對(duì)4種脂肪酸進(jìn)行定量分析與比較,結(jié)果見表3。

圖 4 實(shí)際樣品采用不同前處理方法后4種脂肪酸的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the four fatty acids in real samples by different pretreatment methods

Fatty acidStandard range/(mg/100 g)M1/(mg/100 g)M2/(mg/100 g)M3/(mg/100 g)DHA15.5-20.3 16.6 16.2 12.5ARA112.0-134.0121.8 114.0 102.1C18∶3n3510.0-672.0535.0 516.5 427.1C18∶2n6c5140.0-6300.05883.0 5448.0 4541.9

從表3可以看出,乙酰氯-甲醇甲酯化法測得的4種脂肪酸的含量最高;乙酰氯-甲醇甲酯化法與酸水解酯化法測定的結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi),而堿水解酯化法測定的結(jié)果低于標(biāo)準(zhǔn)值,尤其對(duì)于含量較低的DHA,不能滿足檢測要求。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了乙酰氯-甲醇甲酯化法和酸水解酯化法在測定嬰幼兒乳粉中不飽和脂肪酸含量的準(zhǔn)確性,相較于堿水解酯化法，更適用于嬰幼兒乳粉中多不飽和脂肪酸的檢測。

3 結(jié)論

本文研究了國家標(biāo)準(zhǔn)[20]中酸水解酯化法、堿水解酯化法、乙酰氯-甲醇甲酯化法3種前處理方法在處理嬰幼兒配方奶粉中不飽和脂肪酸時(shí)的差異性。通過分析實(shí)驗(yàn)過程,得出乙酰氯甲醇甲酯化法和酸水解酯化法更適用于嬰幼兒配方奶粉中多不飽和脂肪酸的檢測,此結(jié)論與標(biāo)準(zhǔn)方法中利用堿水解法對(duì)乳粉及液體乳等試樣進(jìn)行水解的描述存在差異。基于奶粉中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及反式脂肪酸等與多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的相似性,本研究的實(shí)驗(yàn)方法也可用于其他脂肪酸的檢測,同時(shí)也對(duì)其他基質(zhì)食品中脂肪酸的測定具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。