基于雙定性原則的高效液相色譜-二極管陣列檢測法分析中藥組分

唐 濤, 楊三東, 趙海青, 談義萌, 封 嬌, 夏明珠, 李 彤*

(1. 南京理工大學工業(yè)化學研究所, 江蘇 南京 210094; 2. 大連依利特分析儀器有限公司, 遼寧 大連 116023; 3. 大連市色譜工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

液相色譜法是20世紀發(fā)展起來的重要分析方法,被廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測、食品安全、藥物分析等領(lǐng)域[1-3]。但是,隨著樣品復雜程度的增加,液相色譜的定性能力受到了越來越大的挑戰(zhàn),根據(jù)色譜保留時間定性容易受雜質(zhì)干擾、出現(xiàn)假陽性。以中藥組分分析為例,中藥的療效主要取決于有效成分的種類及含量,通常以其中某個組分的含量作為質(zhì)量控制點。在2015版《中國藥典》一部[4]中,新增和修訂的957個中藥品種有569個涉及液相色譜法,大部分以被測組分的保留時間作為定性依據(jù)。但由于中藥成分十分復雜,又經(jīng)過多種配伍,存在與目標組分保留時間基本一致或相近的干擾物,采用液相色譜紫外-可見檢測法可能引起定性和定量結(jié)果的錯誤[5]。因此,如何提高液相色譜法的定性能力是近年來儀器分析領(lǐng)域的研究熱點之一。

提高色譜系統(tǒng)的分離能力,包括利用亞2 μm的超高效液相色譜[6]、使用具有超高柱效的超長色譜柱[7]及多維分離技術(shù)[8,9]等,可以降低定性的難度,但沒有真正提高系統(tǒng)的定性能力。另一種方式利用更多的聯(lián)用技術(shù),包括液相色譜-質(zhì)譜[10]、液相色譜-核磁共振[11]、液相色譜-原子熒光[12]等,這些方法在研究領(lǐng)域報道較多,但這幾類檢測器都十分昂貴,普適性不高,推廣難度較大。二極管陣列檢測器(DAD)作為較成熟的檢測器已被多個國外廠家和少數(shù)國內(nèi)廠家商品化,具有同時輸出全波段色譜圖和實時掃描光譜的功能[13]。Bitas等[14]采用HPLC-DAD法,在255和275 nm條件下完成了蝦中6種喹諾酮類藥物殘留的檢測;Ricciutelli等[15]利用二極管陣列檢測器獲取6個波長的色譜信息,同時定量檢測9種橄欖油中的多酚物質(zhì)。但在應用方面,二極管陣列檢測器往往只是被作為一個多波長的、甚至普通的紫外-可見檢測器使用,光譜功能在定性上的應用報道不多。在我們的前期工作[16]中,成功研制了二極管陣列檢測器,具有良好的儀器研制基礎(chǔ)。

基于自構(gòu)建的新型二極管陣列檢測器及其高分辨的光譜掃描功能,以色譜保留時間結(jié)合樣品吸收光譜圖為定性原則,對中藥樣品進行了分析,有效避免了假陽性結(jié)果,為中藥組分分析提供了參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

iChrom 5100高效液相色譜系統(tǒng),配置有二極管陣列檢測器(自構(gòu)建)、P5102二元高壓恒流泵、M5102系統(tǒng)組織器、S5101自動進樣器、O5101色譜柱恒溫箱和W5100色譜數(shù)據(jù)工作站,SinoChrom ODS-BP色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)、SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和SinoPak C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司); AE100S電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); WB-1010A恒溫水浴鍋(天津奧特賽恩斯儀器有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)。

五味子醇甲對照品(純度≥99% )和金胺O對照品(純度≥99% )(中國藥品生物制品檢定所);甲醇和乙腈(均為色譜純,美國Tedia試劑公司);乙醇、磷酸二氫鉀、三乙胺、碘化鈉和亞硝酸鈉(均為分析純,天津科密歐化學試劑有限公司);棗仁天麻膠囊、黃柏、延胡索、黃連、菟絲子、石斛和蒲黃均為市售商品。

1.2 實驗條件

1.2.1二極管陣列檢測器的評價

雜散光測試:稱取10.0 g碘化鈉和50.0 g亞硝酸鈉,分別配制10 g/L的碘化鈉水溶液和50 g/L的亞硝酸鈉水溶液。使用注射器將空白水溶液注入檢測池,待檢測器示值穩(wěn)定后,掃描背景光譜;再分別注入碘化鈉和亞硝酸鈉水溶液,掃描透過光譜。觀察碘化鈉水溶液在220 nm、亞硝酸鈉水溶液在340 nm是否透光,透光說明存在雜散光。

氧化鈥玻璃濾光片測試:打開氘燈,等能量讀數(shù)穩(wěn)定,掃描氘燈光譜,記錄每個光電二極管能量值En;將氧化鈥玻璃置于檢測池前端,穩(wěn)定幾秒后再次掃描光譜,記錄能量值En′。計算透過率Tn=En′/En,繪制透過率曲線,并讀取特征吸收值與理論值(241.6、279.2、287.6、360.6、445.6和536.3 nm),進行比較,計算偏差。

1.2.2金胺O的測試

金胺O對照品溶液的配制:稱取金胺O對照品50.0 mg,用70%(體積分數(shù),下同)乙醇水溶液溶解并定容到100 mL容量瓶中,制成500 mg/L金胺O對照品儲備液。分別用70%乙醇水溶液稀釋上述儲備液,定容至10 mL,得到質(zhì)量濃度為0.5、1.0、10.0、25.0、50和100 mg/L的金胺O標準工作液。

樣品前處理:取2.0 g藥材粉末樣品于50 mL具塞錐形瓶中,加20 mL 70%乙醇水溶液,超聲提取20 min,提取液用0.45 μm有機濾膜過濾,取濾液進樣分析。

色譜條件:流動相為35∶65(v/v)的乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.2%三乙胺,用磷酸調(diào)pH值至3.0);色譜柱為SinoChrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm, 5 μm);檢測波長為432 nm;流量為1.0 mL/min;進樣量為20 μL;溫度為室溫。

1.2.3五味子醇甲的測試

五味子醇甲對照品溶液的配制:稱取2.3 mg五味子醇甲對照品,置于50 mL容量瓶中,純甲醇超聲溶解并定容后作為儲備液。準確移取儲備液2 mL于10 mL容量瓶中,用純甲醇稀釋后定容,即得9.2 mg/L的五味子醇甲對照品溶液。

棗仁天麻膠囊樣品前處理方法:取裝量差異下的棗仁天麻膠囊適量,混勻后研細,精密稱取0.50 g粉末于100 mL具塞錐形瓶中,精確加入80%甲醇水溶液50 mL,密塞,稱定重量。在80 ℃水浴中加熱回流20 min,冷卻至室溫,再稱定重量,用80%甲醇水補足減失的重量。搖勻,過濾,取濾液,即得供試品溶液。

色譜條件:流動相為55∶45(v/v)的甲醇-水;色譜柱為SinoPak C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和SinoChrom ODS-BP(200 mm×4.6 mm, 5 μm);檢測波長為250 nm;流量為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為20 μL。

圖 1 二極管陣列檢測器Zemax模擬圖Fig. 1 Zemax simulated diagram of diode array detector (DAD)

2 結(jié)果與討論

2.1 二極管陣列檢測器的構(gòu)建與評價

以橢球鏡、輪胎鏡和平場光柵為主要光學件,設(shè)計并組裝了一種全新的二極管陣列檢測器,其Zemax光路模擬圖見圖1。光源和檢測池分別放置在橢球鏡的兩個焦點位置,氘燈發(fā)出的光首先通過光闌,經(jīng)過橢球鏡聚焦到檢測池中心;通過檢測池的出射光照射到輪胎鏡上,然后聚焦到狹縫,進一步經(jīng)過平場光柵分光,成像到陣列探測器上;再經(jīng)過光電轉(zhuǎn)換成信號值。

圖 2 (a) Zemax成像模擬結(jié)果和(b)氘燈光譜圖Fig. 2 (a) Simulation results of Zemax imaging and (b) the spectrogram of the deuterium lamp

選取氘燈光譜的3個特征波長254、486和656 nm作為輸入?yún)?shù),利用Zemax軟件模擬光路方案成像效果,結(jié)果如圖2a所示。成像光斑的均方根半徑值和幾何半徑值均小于1 mm, 3個波長成像點位置重合,說明在理論上設(shè)計的光路沒有色差,成像質(zhì)量好。利用碘化鈉和亞硝酸鈉水溶液分別在220和340 nm測試透過率,結(jié)果顯示無雜散光。傳統(tǒng)的二極管陣列檢測器,通常采用透鏡組的結(jié)構(gòu),并利用多組黑擋片減弱色差對成像的影響。本文設(shè)計的二極管陣列檢測器采用離軸非球面反射的原理,設(shè)計了雙焦點的橢球鏡和高反射效率的輪胎鏡兩個關(guān)鍵器件,從光路設(shè)計上將色差和雜散光的影響降到最低。

將氘燈置于光源位置,測試光譜圖如圖2b所示,特征峰486.0和656.1 nm峰形尖銳。以兩點特征波長值與陣列數(shù)的對應關(guān)系進行線性擬合,得到方程為y=1.13x+186.28,y為特征波長值(單位nm),x為陣列數(shù)。進一步利用氧化鈥玻璃濾光片的6點特征波長驗證系統(tǒng)波長準確性,結(jié)果最大偏差為0.8 nm。汞燈是一種理想的多波長線光源,將其置于光源位置,測試光譜圖,特征線253.7 nm的半峰寬為1.9 nm。與常規(guī)色譜用紫外-可見檢測器8～10 nm水平相比,性能提高約5倍,接近商品化紫外-可見分光光度計指標,有利于采集準確的樣品光譜信息,這也是利用光譜進行輔助定性的重要保障。

2.2 金胺O測試結(jié)果

金胺O是一種化學染色劑,對人體有一定毒性作用,被列為非食用物質(zhì),在中藥材、中藥飲片和中成藥中均不得檢出。但一些不法商販將其用于劣質(zhì)黃柏、蒲黃、延胡索等中藥材、中藥飲片的非法染色。2015年,國家食品藥品監(jiān)管總局曾通報了9批次中藥及中藥飲片檢出金胺O[17]。

采用50 mg/L的金胺O標準溶液,連續(xù)5次進樣,保留時間和峰面積RSD值分別為0.42%和0.79% ,說明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。以標準工作液為分析對象,按質(zhì)量濃度從低到高進樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制校準曲線,y=66.17x+3.35(y為峰面積,x為質(zhì)量濃度,單位為mg/L),相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9,說明該方法線性相關(guān)性良好。以3倍信噪比對應的質(zhì)量濃度為儀器檢出限,10倍信噪比對應的質(zhì)量濃度為儀器定量限,得到檢出限為0.02 mg/L,定量限為0.06 mg/L。

以市售的黃柏、延胡索、黃連、菟絲子、石斛和蒲黃為檢測對象,采用1.2.2節(jié)方法進行檢測,結(jié)果見圖3a。以保留時間為考察指標,金胺O對照品出峰時間為12.48 min,黃柏、延胡索、黃連、菟絲子、石斛5種藥材樣品譜圖在對應出峰時間位置均無明顯出峰,說明不含金胺O。蒲黃樣品譜圖中12.55 min有0.58 mAU的未知組分峰檢出。為進一步確證,提取了對照品和未知組分的光譜圖(見圖3b)。未知組分光譜圖及特征吸收峰與對照品截然不同,說明未知組分不是金胺O。

圖 3 (a)金胺O對照品和中藥飲片色譜疊加圖和(b)金胺 O對照品和蒲黃中未知組分吸收光譜疊加圖Fig. 3 Stacked chromatograms of (a) auramine O reference and herbal slices, and (b) auramine O reference and unknown component in pollen typhae

2.3 五味子醇甲測試結(jié)果

五味子是一味中藥,2015版《中國藥典》一部[4]中將采用液相色譜法測定五味子醇甲作為五味子含量測定的推薦方法。棗仁天麻膠囊是由酸棗仁、五味子、天麻等組成的復方中成藥,主要用于改善睡眠。以市售某品牌棗仁天麻膠囊為樣品,按1.2.3節(jié)方法測試,采用不同品牌的C18色譜柱分析,結(jié)果見圖4。由于不同固定相作用力的差異,對照品出峰時間分別為11.29和27.41 min,樣品中兩個未知組分在圖4a和圖4b中分別與對照品出峰時間對應,疑似目標成分。

圖 4 不同色譜柱分析五味子醇甲對照品和樣品色譜疊加圖Fig. 4 Stacked chromatograms of the schisandrin reference and the sample with different chromatographic columns a. SinoPak C18; b. SinoChrom ODS-BP.

提取對照品和樣品中兩個未知組分峰的光譜圖,如圖5所示,未知組分1在301.2 nm有明顯吸收,對照品在此波長下基本沒有響應;未知組分2最大吸收峰出現(xiàn)在209.6 nm,次大吸收峰為255.4 nm,對照品的最大吸收峰和次大吸收峰分別為217.1和252.1 nm。比對結(jié)果說明,樣品中的兩個未知峰均不是目標物質(zhì)五味子醇甲。

圖 5 五味子醇甲對照品和樣品中未知組分光譜疊加圖Fig. 5 Stacked spectrograms of the schisandrin reference and the unknown components in sample

為了進一步驗證,在樣品中按1∶1的體積比添加對照品,使用疏水性更強的SinoChrom ODS-BP色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm),調(diào)整流動相比例,增加甲醇含量至60% ,進行分析,結(jié)果見圖6。對照品的出峰時間延長至14.58 min,加標樣品中五味子醇甲的峰面積與對照品的峰面積之比為1∶2。樣品中的兩個未知組分保留時間分別為13.58和16.14 min,實現(xiàn)了基線分離。提取加標樣品譜圖中3個色譜峰的光譜圖,結(jié)果與圖5中對照品、兩個未知組分一致,確認未知峰不是五味子醇甲。

圖 6 五味子醇甲對照品和棗仁天麻膠囊加標樣品的疊加譜圖Fig. 6 Stacked chromatograms of the schisandrin reference and spiked Jujube kernel Tianma capsule sample

3 結(jié)論

經(jīng)典的液相色譜分析方法采用保留時間作為定性的主要依據(jù)。本文所列舉的兩個實例(蒲黃中的金胺O和棗仁天麻膠囊中的五味子醇甲)在常規(guī)分析中,目標物出峰位置都有未知組分峰出現(xiàn)。如果單以保留時間為依據(jù),均會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果,會將質(zhì)量良好的蒲黃錯誤地認為加入了非法添加劑、將不含五味子醇甲的棗仁天麻膠囊錯誤地定為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。因此,利用保留時間/吸收光譜雙定性原則可以快捷地辨識保留時間相似的雜質(zhì)峰,微調(diào)分析條件可以獲得更理想的分離效果,為中藥組分研究提供了普適性的參考方法。