QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同植被類型土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

王璐芳, 李春梅, 許佳彬, 李 慧, 蘇 杭, 王 靜, 金 芬*, 張 宇*

(1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 海口 570228; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 北京 100081)

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(strobilurin fungicides)是一類廣譜性殺菌劑,對擔(dān)子菌綱、半知菌綱和卵菌綱等真菌具有高殺菌活性[1-5]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑由于其獨(dú)特作用機(jī)制及廣譜殺菌活性,已成為繼苯丙咪唑類和三唑類殺菌劑之后極具市場潛力的一類殺菌劑。目前甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑種類已達(dá)15種,其中肟菌酯、氟嘧菌酯和啶氧菌酯的農(nóng)藥市場占比分別達(dá)到18.45% 、5.52%和5.05%[6];此外,烯肟菌酯、丁香菌酯、烯肟菌胺、氯啶菌酯和唑菌酯等的登記使用范圍也逐漸擴(kuò)大,而有關(guān)此類殺菌劑的檢測方法及殘留水平等研究缺乏,有必要建立該類殺菌劑的多殘留檢測方法。大部分甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在施用后,會(huì)進(jìn)入土壤,具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[7,8]。已有研究表明,脂溶性強(qiáng)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在土壤中易與土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合,也可通過雨水淋溶等方式進(jìn)入水體,進(jìn)一步影響水生生物,從而通過食物鏈威脅人類健康[9]。近年來甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的毒性也日益受到關(guān)注,醚菌酯、啶氧菌酯及肟菌酯能引起大鼠輕微肝細(xì)胞水腫[10]、赤眼蜂行為異常[11]及魚類胚胎發(fā)育不正常[12-14]等。因此,研究建立土壤中的丁香菌酯、唑菌酯、烯肟菌胺、氯啶菌酯、肟醚菌胺、E-苯氧菌胺、醚菌酯、醚菌胺、啶氧菌酯、肟菌酯及氟嘧菌酯等11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的多殘留分析方法對研究其環(huán)境行為及風(fēng)險(xiǎn)評估等具有重要意義。

目前,土壤中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測方法已有報(bào)道[15-18]。郭敏等[15]采用丙酮提取測定了土壤中的啶氧菌酯和肟菌酯。丁琦等[16]采用乙腈振蕩提取、石油醚復(fù)溶后中性氧化鋁柱層析凈化法測定了土壤中丁香菌酯的殘留。Herrerohernández等[17]采用甲醇提取了土壤中的嘧菌酯。然而,這些方法只針對其中幾種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。

我國農(nóng)業(yè)土壤類型豐富,主要包括南方紅黃壤、黃土性土壤、干旱區(qū)土壤、東北森林草原土壤和砂土等。不同類型的土壤有機(jī)質(zhì)含量、粘粒含量及酸堿度等理化性質(zhì)差別很大,其所含的色素、腐殖質(zhì)等極性雜質(zhì)的含量亦有所不同,對農(nóng)藥的吸附特性也不同[19],因此,針對不同植被類型土壤進(jìn)行提取凈化的效果也有所不同。本文根據(jù)我國農(nóng)業(yè)區(qū)土壤的分布和理化性質(zhì),采集了6種典型的植被類型土壤(黑土、紅壤土、砂土、潮土、灰漠土、高山土),以此為研究對象,考察了不同凈化劑對11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑回收率的影響,建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測定土壤中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS 8050(日本Shimadzu公司), ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司)。高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司),超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司),渦旋混合器(美國Scientific Industries公司),電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司), Milli-Q超純水發(fā)生器(德國Merck公司)。

甲醇和乙腈均為HPLC級,購自德國Merck公司;N-丙基乙二胺(PSA, 40～60 μm)、C18(40 μm)和多壁碳納米管(MWNT, 18～20 nm)購自天津博納艾杰爾科技公司;石墨化碳黑(GCB, 38～120 μm)購自美國Sigma-Aldrich公司。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于90% ,其中丁香菌酯、唑菌酯和烯肟菌胺購自美國Chemtek公司,氟嘧菌酯、氯啶菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌胺和E-苯氧菌胺購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱取11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,用甲苯定容至10 mL,配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的儲備液,密封后避光存于4 ℃,備用。分別取上述配制好的單標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各1 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,配制成20 mg/L的工作液,備用。

土壤樣品:黑土、灰漠土、高山土、潮土、紅壤土和砂土分別采自中國吉林、新疆、青海、河北、江西、海南6地,風(fēng)干,過2 mm篩,4 ℃保存待用。6種土壤的理化性質(zhì)見表1。

表 1 6種植被類型土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the six vegetation types of soil

CEC: cation exchange capacity.

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取風(fēng)干的10.0 g土樣于50 mL塑料離心管中,加入10 mL 0.1%(v/v)醋酸乙腈,渦旋混勻1 min,超聲提取5 min,以6 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液置于含有PSA和C18的5 mL離心管中,渦旋1 min,以6 000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm濾膜,待測。

1.3 LC-MS/MS條件

色譜條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣體積為1 μL。流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為水,流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 40%A, 60%B; 1.0～2.5 min, 60%A, 40%B; 2.5～4.0 min, 80%A, 20%B; 4.0～5.5 min, 90%A, 10%B; 5.5～8.5 min, 40%A, 60%B。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧離子源,正離子模式,掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表 2 11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and mass parameters of the 11 strobilurin fungicides

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

* Quantitative ion.

圖 1 11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(50 μg/kg)在不同流動(dòng)相條件下的色譜圖比較Fig. 1 Comparison of chromatograms of the 11 strobilurin fungicides (50 μg/kg) in different mobile phases

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件優(yōu)化

本研究比較了有機(jī)相甲醇和乙腈對11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑分離效果的影響,如圖1所示,當(dāng)采用乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí),僅丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺和E-苯氧菌胺的響應(yīng)值較高,氟嘧菌酯未出峰,這可能是因?yàn)榉拙O性較強(qiáng),應(yīng)使用極性更強(qiáng)的甲醇對該藥進(jìn)行洗脫。而當(dāng)采用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),氟嘧菌酯出峰(保留時(shí)間為2.62 min), 11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均得到較好分離,保留時(shí)間為2.20～3.81 min,且氯啶菌酯、唑菌酯和醚菌酯等峰的響應(yīng)均有所提高。這可能是因?yàn)榧状紝儆谫|(zhì)子性有機(jī)溶劑,使目標(biāo)物更容易質(zhì)子化,提高了目標(biāo)物的洗脫能力,從而提高了檢測的靈敏度[20]。因此,本研究選擇甲醇-水作為分離11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的流動(dòng)相。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

近年來QuEChERS在提取土壤及食品中的農(nóng)藥上應(yīng)用廣泛[21,22]。針對土壤基質(zhì)較為復(fù)雜,含有有機(jī)質(zhì)及色素等多種雜質(zhì),本文采用QuEChERS方法對土壤基質(zhì)中的干擾物進(jìn)行凈化,提取11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。目前,QuEChERS方法常用的吸附凈化劑主要包括GCB、MWNT、C18和PSA等,其中GCB和MWNT對色素有較好的吸附效果,PSA對土壤中的極性共提取物有較好的吸附,而C18可以去除基質(zhì)的非極性雜質(zhì)[23]。本文首先比較了4種不同凈化劑(GCB、MWNT、C18及PSA各50 mg)對超純水中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的吸附效果。結(jié)果表明,GCB和MWNT對11種目標(biāo)物有較強(qiáng)的吸附能力,幾乎將丁香菌酯、氯啶菌酯、烯肟菌胺及唑菌酯全部吸附。又以有機(jī)質(zhì)含量最高的黑土作為基質(zhì)進(jìn)行凈化研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)GCB和MWNT處理后的土壤基質(zhì)中丁香菌酯、氯啶菌酯、烯肟菌胺和唑菌酯的回收率僅為3.38% ～62.53% ,進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩種凈化劑對目標(biāo)物有較強(qiáng)的吸附能力[24],不適合對土壤中丁香菌酯、氯啶菌酯等藥物的凈化。而經(jīng)PSA和C18處理后的土壤基質(zhì)中目標(biāo)物回收率為30.6% ～94.9% ,且與GCB和MWNT相比,PSA可吸附部分色素,達(dá)到凈化除色的效果,因此本研究選擇PSA和C18作為吸附凈化劑。

進(jìn)一步優(yōu)化PSA和C18的用量與組成。如圖2所示,當(dāng)100 mg PSA和100 mg C18單獨(dú)使用時(shí),除E-苯氧菌胺外,其余10種目標(biāo)物的回收率均較低;當(dāng)PSA和C18用量分別提高至200 mg時(shí),回收率得到較大提高,達(dá)到80.5% ～95.4% ;當(dāng)100 mg PSA和100 mg C18凈化劑混合使用時(shí),11種目標(biāo)物的回收率為94.1% ～112.1% ,能更好地滿足檢測需要。因此,最終選擇100 mg PSA和100 mg C18作為該方法的吸附劑。

圖 2 不同量的PSA和C18對黑土中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的凈化效果(n=3)Fig. 2 Effects of different amounts of PSA and C18 on the purification of the 11 strobilurin fungicides in black soil (n=3)

CompoundMoisture soilSandy soilBlack soilRed soil Plateau soilDesert grey soilCoumoxystrobin0.870.850.860.870.850.91Picoxystrobin0.870.820.891.030.961.04Tricyclopyricarb0.930.860.951.041.001.08Fluoxastrobin0.890.830.911.050.971.05E-Metominostrobin0.920.850.951.001.001.04Fenaminstrobin0.950.880.961.121.081.12Orysastrobin0.910.850.941.091.021.06Trifloxystrobin0.890.830.880.970.940.97Pyraoxystrobin0.940.870.920.970.951.02Dimoxystrobin0.890.830.860.930.900.94Kresoxim-methyl0.860.810.840.900.880.94

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)指樣品提取液中除目標(biāo)物外的其他組分對定量分析準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的影響[25],采用式(1)計(jì)算:

ME=km/ks

(1)

其中km為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,ks為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。參照1.2節(jié)方法對空白土壤樣品進(jìn)行前處理,制備空白基質(zhì)溶液。分別用純?nèi)軇┖涂瞻谆|(zhì)溶液配制藥物濃度相同的工作液,在相同儀器條件下檢測,以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果如表3所示,6種不同類型植被土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的ME值為0.81～1.12,基質(zhì)效應(yīng)相對較小,表明本文所建立的QuEChERS前處理方法對目標(biāo)藥物的提取凈化效果較好。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在潮土、砂土和黑土3種土中均呈現(xiàn)微弱的基質(zhì)抑制效應(yīng),ME值為0.81～0.96;而在紅壤土、高山土和灰漠土中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑則呈現(xiàn)了不同的基質(zhì)效應(yīng)。丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺和醚菌酯等5種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在紅壤土、高山土和灰漠土(除唑菌酯外)中均呈現(xiàn)為弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME值為0.87～0.97);啶氧菌酯、氯啶菌酯、氟嘧菌酯、E-苯氧菌胺、烯肟菌胺和肟醚菌胺等6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在紅壤土、高山土(除氟嘧菌酯和啶氧菌酯外)和灰漠土中均表現(xiàn)為微弱的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME值為1.00～1.12。因此,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對樣品進(jìn)行定量分析,以減少基質(zhì)效應(yīng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

如表4所示,采用優(yōu)化后的分析方法,將配制的工作液用處理后的空白土壤基質(zhì)逐級稀釋成質(zhì)量濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.5和0.1 μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。11種殺菌劑在0.1～100 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.980 5～0.999。分別以3倍和10倍信噪比確定該類藥物在土壤中的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表4。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在6種土壤中的LODs值為0.005～2.3 μg/kg,低于現(xiàn)有文獻(xiàn)方法[26,27]的LODs,可以滿足我國土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的痕量檢測要求。

表 5 不同植被類型土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 5 Average recoveries and RSDs of the 11 strobilurin fungicides in different vegetation types of soil (n=3)

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在6種空白土壤中分別添加5、10和50 μg/kg水平的11種殺菌劑的混合標(biāo)準(zhǔn)液,每個(gè)水平重復(fù)3次,按照本方法對樣品進(jìn)行提取并檢測,得到各添加水平下的平均回收率分別為65.1%～90.6% 、73.8%～95.8% 、80.5%～103.9% ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.082%～7.8% 、0.13%～5.6% 、0.12%～14.0% ,結(jié)果見表5。

2.6 實(shí)際樣品的檢測

采用本文所建立的方法,分別對3個(gè)采自不同地點(diǎn)(河北、北京和海南)的土壤樣品進(jìn)行檢測。在河北和海南的土壤樣品中均檢出了丁香菌酯(含量分別為0.1和0.2 μg/kg)、氯啶菌酯(均為0.2 μg/kg)和醚菌酯(均為0.2 μg/kg),其他8種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均未檢出。結(jié)果表明,本方法適用于土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的檢測。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定不同植被土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法。該方法簡便快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高、線性關(guān)系良好,適用于不同類型土壤中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的分析。