RADA-16自組裝多肽的合成表征及負(fù)載BMP-2的細(xì)胞相容性研究

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(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷外科，海南 ?？?570102)

骨缺損因自體骨移植受到自體骨源有限的限制，往往不能達(dá)到完全填充骨缺損區(qū)所需要的骨量，隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，人造骨組織填充材料不斷出現(xiàn)，其可以填充骨缺損區(qū)域并促進(jìn)缺損區(qū)域骨生長(zhǎng)愈合，提高治療效果，縮短治療時(shí)間[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)具有原位成骨和異位成骨作用，目前大量的實(shí)驗(yàn)和臨床資料表明BMP-2具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性，能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[2]。但是大劑量BMP-2價(jià)格昂貴，半衰期短，且容易異位成骨，具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，因而限制了BMP-2在臨床中的應(yīng)用。

目前國(guó)際上常用的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米微球包載技術(shù)存在包封率不理想等問題，且包封過程中需要使用氯仿，氯仿有生物毒性，這也限制了PLGA緩釋微球的使用。RADA-16是目前研究較成熟的自組裝納米短肽材料，具有自組裝成膠容易控制、無細(xì)胞毒性、可被吸收、無免疫原性等特點(diǎn)[3]。有研究證明，RADA-16膠體的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以誘導(dǎo)干細(xì)胞長(zhǎng)入，有助于干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖[4]。RADA-16成膠過程中可以加入BMP-2，成膠后將形成特殊的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將BMP-2分子網(wǎng)在膠體內(nèi)。隨著膠體的分解吸收，膠體內(nèi)的BMP-2逐漸被釋放出來，達(dá)到緩釋成骨誘導(dǎo)因子的作用。本課題使用RADA-16納米自組裝多肽作為BMP-2的載體，既獲得了良好的可塑形性，又獲得了良好的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

新西蘭大白兔10只，6月齡，雌雄各半，體質(zhì)量3 kg左右，購(gòu)自南昌大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；RADA-16(氨基酸序列：ACN-RADARADARADARADA-CONH2)，純度大于90%，購(gòu)自上海生物工程有限公司；兔淋巴細(xì)胞分離液、鏈霉素、PBS緩沖液和青霉素購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白酶和L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)PE公司；EM-30Plus掃描電鏡購(gòu)自庫(kù)賽姆中國(guó)，IX71倒置熒光顯微鏡和IME-II倒置相差顯微鏡日本Olympus公司。

1.2 多肽的溶解

把10 g蔗糖溶于90 mL去離子水中，完全溶解后分裝到2個(gè)離心管中，各50 mL。分別取蔗糖溶液1 mL與RADA-16粉10 mg溶于2 mL微型管中，在37 ℃恒溫下懸浮超聲30 min。

1.3 多肽的自組裝

在2 mL微型管中，加入500 μL RADA-16溶液和500 μL的DMEM/F12培養(yǎng)基，用移液管槍頭輕輕吹打混合。使RADA-16溶液得最終濃度為0.5%。在37 ℃溫箱中孵育30 min后倒置，并觀察多肽自組裝的情況。

1.4 珊瑚微結(jié)構(gòu)的觀察

樣本鍍金處理，通過50～100倍掃描電鏡(冷場(chǎng))掃描高壓蒸汽滅菌后的珊瑚塊，采用圖像分析軟件(Topomatrix)對(duì)掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 RADA-16-珊瑚超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

超聲處理制備完成的RADA-16溶液20 min，之后把超聲后RADA-16溶液浸沒珊瑚中，并加入相同體積的細(xì)胞DMEM/F12培養(yǎng)基，脫水至黏樣粉末狀，之后對(duì)粉末樣本進(jìn)行鍍金處理，通過100～1 000倍掃描電鏡(冷場(chǎng))檢測(cè)，Topomatrix圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 RADA-16-珊瑚-BMP-2復(fù)合材料超微結(jié)構(gòu)觀察

將同體積的RADA-16與BMP-2溶液混合后浸沒于珊瑚小塊中，同樣加入DMEM/F12培養(yǎng)基觸發(fā)自組裝的發(fā)生。脫水至黏樣粉末狀，之后對(duì)粉末樣本進(jìn)行鍍金處理，通過10 000倍掃描電鏡(冷場(chǎng))檢測(cè)，Topomatrix圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 RADKPS 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

1.7.1 兔BMSCs分離培養(yǎng) 用0.5 mL氯胺酮通過肌肉注射麻醉新西蘭大白兔后，抽取約3 mL脛骨下方穿刺的骨髓，迅速加入到15 mL離心管中，并立即加入2 mL肝素鈉，混勻搖晃，對(duì)兔BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，2 000 r/min離心20 min后，吸取單個(gè)骨髓核細(xì)胞，PBS洗滌2遍后進(jìn)行離心計(jì)數(shù)，并用5 mL的L-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1×106個(gè)/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，在濕度培養(yǎng)箱中行原代培養(yǎng)，每48 h換液，3次PBS沖洗后，棄去未貼壁的細(xì)胞，之后每2天換液1次，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)。

1.7.2 BMSCs細(xì)胞活性染色觀察 取第3代BMSCs細(xì)胞，在0.25%胰蛋白酶消化后，配置濃度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板培養(yǎng)(100 μL/孔)；培養(yǎng)24 h后，分為3組，第1組加100 μL RADA-16/珊瑚/BMP-2溶液，命名為實(shí)驗(yàn)組1，第2組加RADA-16/珊瑚溶液，命名為實(shí)驗(yàn)組2，第3組加珊瑚溶液，命名為對(duì)照組，置于FDA/PI避光培養(yǎng)；在37 ℃下孵育5 min后，用PBS每隔3 min沖洗1次，沖洗3次后，利用倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 多肽自組裝形成凝膠多肽

RADA-16溶解后形成無色透明水凝膠，微形管倒置30 min后凝膠仍緊密黏附于管底，無滑脫(圖1)。

a:形成無色透明水凝膠;b:凝膠黏于管底

2.2 珊瑚微結(jié)構(gòu)的觀察

珊瑚于電鏡下呈多孔狀結(jié)構(gòu)，孔隙排布緊密，大小均勻，孔隙大小從200 μm到500 μm不等(圖2a)。130倍掃描電鏡下觀察，RADA-16自組裝多肽凝膠均勻附著于珊瑚孔隙中(圖2b)。掃描電鏡圖像顯示在珊瑚空隙中多肽RADA-16自組裝形成納米纖維及片層堆疊結(jié)構(gòu)，其直徑從幾微米到幾十微米不等(圖2c)。

2.3 掃描電鏡圖像顯示

自組裝多肽的納米結(jié)構(gòu)分布于珊瑚的空隙中，而在自組裝多肽的納米架構(gòu)上，均勻黏附著骨形態(tài)發(fā)生蛋白顆粒。由此，珊瑚、自組裝多肽、骨形態(tài)發(fā)生蛋白三者形成了層層遞進(jìn)的超微復(fù)合材料體系(圖2d)。

a:50倍電鏡下掃描;b:130倍電鏡下掃描;c:1000倍掃描電鏡下觀，珊瑚孔隙中RADA-16自組裝多肽凝膠形成規(guī)則納米纖維及片層結(jié)構(gòu);d:10 000倍掃描電鏡下觀察骨BMP-2均勻附著于RADA-16自組裝多肽凝膠上

圖2珊瑚電鏡掃描圖像

2.4 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

倒置相差顯微鏡觀察示，第3代新西蘭大白兔BMSCs呈長(zhǎng)梭形，漩渦樣生長(zhǎng)。培養(yǎng)3 d后，BMSCs和不同系統(tǒng)的細(xì)胞相容性顯示，生存細(xì)胞發(fā)綠色熒光，死亡細(xì)胞發(fā)紅色熒光。BMSCs培養(yǎng)過程中，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組內(nèi)BMSCs未見明顯死亡細(xì)胞(圖3)。

3 討論

種子細(xì)胞、生物材料和調(diào)控因子這三種主要的基本元素組合在一起組成了組織工程，體外模擬組織再生發(fā)現(xiàn)這三者的組合能夠達(dá)到修復(fù)組織損傷與退變的功能。而在這三要素中，具有良好生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)的材料少之又少。以往的使用中，用到如殼聚糖、藻酸鹽等材料，這些材料遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到人天然骨組織的性能，因此構(gòu)建出具有提供合適的微環(huán)境給種子細(xì)胞增殖分化且具有優(yōu)良生物學(xué)活性的生物材料成了目前的研究熱點(diǎn)[5-6]，其中，自組裝多肽納米纖維凝膠尤其被關(guān)注[7]。劉龍剛等[8]制備并評(píng)價(jià)載有BMP-7功能片段的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADKPS的生物相容性，為其在退變髓核再生領(lǐng)域中的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這是由于肽種的氨基酸之間的眾多相互作用使其自身擁有復(fù)雜的自組裝納米結(jié)構(gòu)。氨基酸間的相互作用類型的主要包括疏水相互作用，靜電、氫鍵相互作用，范德華力以及芳族相互作用(π-π堆疊)[9]，因此可以利用這些氨基酸間的相互作用的特性影響肽的自組裝行為，使其生物材料功能性發(fā)揮出來，成為自組裝多肽納米纖維凝膠[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，由于其規(guī)則排列形成的三維超微結(jié)構(gòu)，自組裝多肽納米纖維凝膠更接近于天然結(jié)構(gòu)的材料性能，而且還具備原來多肽分子的生物性能[12]。

a:BMSCs細(xì)胞形態(tài);b:對(duì)照組(珊瑚組)；c:實(shí)驗(yàn)組1(RADA-16/珊瑚/BMP-2組)；d:實(shí)驗(yàn)組2(RADA-16/珊瑚組)

圖3培養(yǎng)3d后，BMSCs和不同系統(tǒng)的細(xì)胞相容性

羥基磷灰石是珊瑚的主要成分，這與骨組織的剛性組成成分較相似，且對(duì)種子細(xì)胞或者活性成分都具有很好的容納性質(zhì)，這是由于珊瑚擁有具有較高孔隙率的孔隙結(jié)構(gòu)。RADA-16是一種含水量很高的自組裝多肽(含水量99%以上)，其實(shí)由陰性氨基酸(A,天門冬氨酸)和陽性氨基酸(R,精氨酸)分別交替組成的，其具有良好的生物相容性[13-15]，可在適宜條件下自發(fā)地發(fā)生分子間自組裝，形成有序三維纖維凝膠支架[16-17]，因此被認(rèn)為是一種理想的組織工程生物支架材料，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞三維培養(yǎng)、藥物緩釋及組織再生中。在本實(shí)驗(yàn)中選用RADA-16作為凝膠組分的柔性部分，能夠更好地在珊瑚剛性結(jié)構(gòu)的保護(hù)下，在珊瑚的孔隙中自發(fā)形成三維結(jié)構(gòu)，這更有助于為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)提供更適宜的微環(huán)境，且進(jìn)一步增加珊瑚孔隙的表面積。研究表明，人體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在BMP-2誘導(dǎo)下形成骨細(xì)胞分化，這一現(xiàn)象也在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)了，因此整個(gè)系統(tǒng)中，BMP-2的加入在微環(huán)境中作為生長(zhǎng)因子起到重要職能[18]。本文發(fā)現(xiàn)RADA-16自組裝能夠形成凝膠，珊瑚50倍電鏡下觀察是呈多孔狀結(jié)構(gòu)，大小均勻，孔隙在200～500 μm范圍內(nèi)，且孔隙緊密排布，130倍掃描電鏡下觀察，RADA-16自組裝多肽凝膠均勻附著于珊瑚孔隙中，1 000倍掃描電鏡顯示RADA-16自組裝形成片層與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其直徑從幾微米到幾十微米不等，10 000掃描電鏡顯示在珊瑚孔隙中，BMP-2黏附于RADA-16，成功合成復(fù)合材料體系(RADA-16、珊瑚、BMP-2)。這與陳辰[19]得到的復(fù)合材料體超微結(jié)構(gòu)具有高度的相似度，陳辰是利用合成含有連接蛋白核心序列Link N的多肽兩親性分子RADA-16，研究其自組裝形成凝膠支架的超微結(jié)構(gòu)，將RADA-16、珊瑚和BMP-2組成復(fù)合材料體，并對(duì)復(fù)合材料體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，但并未對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行研究。

通過BMSCs分離培養(yǎng)觀察到該新型功能化RADA-16自組裝多肽的合成表征及負(fù)載BMP-2對(duì)BMSCs細(xì)胞無毒性反應(yīng)，這與劉紀(jì)恩等[20]的研究成果一致，其通過合成RADA-16-骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2相關(guān)多肽(P24)表面修飾活性多肽并在體外誘發(fā)其進(jìn)行自組裝,共價(jià)修飾聚乳酸羥基乙酸(PLGA)結(jié)合成RADA-16-P24-PLGA共聚物，檢測(cè)與骨BMSCs細(xì)胞的毒性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)無毒性反應(yīng)，這意味著裝載有BMP-2功能片段RADA-16/珊瑚納米水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其修復(fù)骨損失的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。