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    四川部分地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染調(diào)查和基因分型研究

    2018-08-02 09:36:44但佳明歐紅萍嚴(yán)光文田一男肖啟程楊亭玉彭廣能王永剛鐘志軍
    關(guān)鍵詞:賈第犢牛亞型

    但佳明,歐紅萍,嚴(yán)光文,田一男,魏 斌,涂 蕊,肖啟程,唐 麗,楊亭玉,彭廣能,王永剛,鐘志軍*

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611130; 2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院,四川 成都 611130; 3.西昌學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,四川 西昌 615000; 4.北川羌族自治縣曲山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,四川 綿陽(yáng) 622750)

    賈第蟲(chóng)(Giardiaduodenalis)又名藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardialamblia)、腸賈第蟲(chóng)(Giardiaintestinalis),寄生于動(dòng)物腸道內(nèi),主要通過(guò)飲水或食物傳播[1],可感染人及某些哺乳動(dòng)物,引起患病動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀[2],是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)[3]。因此,對(duì)賈第蟲(chóng)進(jìn)行流行情況調(diào)查與基因型研究越來(lái)越受到科學(xué)家的重視。賈第蟲(chóng)是一個(gè)復(fù)雜的集合體,目前已鑒定8個(gè)(A~H)不同的集聚體,各集聚體之間存在宿主特異性[4-5]。其中,集聚體A和B主要感染人和多種哺乳動(dòng)物,集聚體C和D主要在犬科動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),集聚體E主要感染偶蹄動(dòng)物,集聚體F主要感染貓科動(dòng)物,集聚體G和H分別在嚙齒類和海洋哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)[6]。引起人類賈第蟲(chóng)病的集聚體主要為集聚體A和B,近年來(lái)有研究[7-9]表明,聚集體C、D、E、F偶爾會(huì)在人中發(fā)現(xiàn),并且包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了集聚體E感染[10],提示上述集聚體也存在一定的人獸共患性。研究表明,奶牛以集聚體A、B、E為優(yōu)勢(shì)集聚體[11-12],在我國(guó)東北、西北部分地區(qū),奶牛以集聚體E為優(yōu)勢(shì)集聚體[13-14],而在河南以集聚體A為優(yōu)勢(shì)集聚體[11]。奶牛作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,在人類生產(chǎn)生活中占有重要地位,賈第蟲(chóng)感染攜帶不僅對(duì)奶牛養(yǎng)殖造成經(jīng)濟(jì)損失,對(duì)人類健康也存在一定的威脅。其中,斷奶前犢牛由于其賈第蟲(chóng)感染率較高[11-12,15],且集中排泄包囊,在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)方面越來(lái)越引起人們的注意[16]。本研究對(duì)四川部分地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查,經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增賈第蟲(chóng)β-giaidin(bg)、tpi和gdh基因序列,對(duì)陽(yáng)性樣品賈第蟲(chóng)集聚體進(jìn)行鑒定,為四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)流行情況以及流行集聚體種類研究提供基礎(chǔ)資料。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(糞便DNA提取試劑盒)購(gòu)自美國(guó)OMEGA Bio-Tek公司;2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

    1.2 樣品采集

    2016年6月至2017年3月在四川省10個(gè)地區(qū)11個(gè)奶牛場(chǎng)(成都、洪雅、阿壩、眉山、資陽(yáng)、安岳、邛崍、青白江、德陽(yáng)各1個(gè)奶牛場(chǎng),綿陽(yáng)2個(gè)奶牛場(chǎng))采集1月齡內(nèi)斷奶前犢牛糞便共計(jì)278份,每份糞樣約50 g,置于潔凈的塑料采樣袋中,做好相應(yīng)標(biāo)記、編號(hào),于4 ℃下保存待檢。

    1.3 樣本DNA提取

    采用改良飽和蔗糖溶液漂浮法處理糞便,得到含糞便及卵囊的沉淀物,按E.Z.N.A.?Stool DNA Kit說(shuō)明書(shū)步驟操作,提取的DNA 置-20 ℃環(huán)境保存。

    1.4 PCR擴(kuò)增

    基于β-賈第素(β-giaidin)基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行檢測(cè),引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件參照Sulaiman 等[17]報(bào)道?;讦?賈第素(β-giaidin)基因鑒定出的陽(yáng)性樣品,使用磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、谷氨酸脫氫酶(gdh)位點(diǎn)進(jìn)行基因亞型鑒定,引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件參照Appelbee等[18]和Caccio等[19]的報(bào)道。反應(yīng)體系均為25 μL,其中包括:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、去離子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL(第1輪PCR產(chǎn)物為第2輪模板)。通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第2套巢式PCR產(chǎn)物,放置于凝膠成像儀內(nèi),使用Image Lab軟件成像拍照。

    1.5 測(cè)序及分析

    將PCR產(chǎn)物陽(yáng)性者送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank中BLAST比對(duì)校正后提交至NCBI。將校正后序列與NCBI上參考序列使用Clustal X比對(duì),使用MEGA 6的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況

    PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,278份樣品中有26份樣品為賈第蟲(chóng)陽(yáng)性,總感染率為9.35%(26/278)。在10個(gè)采樣地區(qū)中,6個(gè)地點(diǎn)檢測(cè)出賈第蟲(chóng)感染陽(yáng)性,感染率在7.69%~46.43%之間?;赽g、tpi和gdh基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別擴(kuò)增26、24、24條序列。經(jīng)序列比對(duì)鑒定,均為集聚體E。將序列提交至NCBI獲得登錄號(hào)(MF671870-MF671908)。

    2.2 基因序列分析

    在NCBI中搜索bg、tpi和gdh相關(guān)參考序列,采用MEGA 6將參考序列與本次研究所得序列進(jìn)行同源性分析?;赽g基因位點(diǎn)(圖1),26條序列形成7種基因亞型,其中4種基因亞型為已知亞型,其序列分別參考KT922247、KY769091、KY769093和KT698677。其余3種為新基因亞型,分別為E13(MF671880)、E14(MF671883)和E16(MF671886)。7種基因亞型中,以E1(n=8)基因亞型為主。

    基于tpi基因位點(diǎn)(圖2),24條序列形成7種基因亞型,其中5種基因亞型為已知亞型,序列參考為KT922261、KT922259、EF654690、KY432848和KY769103。其余2種為新基因亞型,分別為E21(MF671904)和E24(MF671907)。其中以E3(n=13)基因亞型為主。

    ?,本實(shí)驗(yàn)所得序列,下同。?,Sequence in this study. The same below.圖1 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)bg基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on bg gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

    圖2 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng) tpi基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on tpi gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

    基于gdh基因位點(diǎn)(圖3),24條序列同樣形成7種基因亞型,其中5種為已知基因亞型,序列參考為KY769096、KT369780、KT368785、KT698971和KY432838。其余2種為新基因亞型:E18(MF671896)和E19(MF671899)。其中以E1(n=9)基因亞型為主。

    本研究中,26份賈第蟲(chóng)陽(yáng)性樣品基于各基因位點(diǎn)均分別發(fā)現(xiàn)7種基因亞型,具體分型結(jié)果見(jiàn)表1。

    圖3 斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)gdh基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on gdh gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

    3 討論

    斷奶前犢奶牛賈第蟲(chóng)感染在我國(guó)各地區(qū)廣泛存在,具有較高的感染率。有研究表明,我國(guó)西北、中部、東北、東南部分地區(qū)感染率分別為9.7%(23/237)[20]、17.6%(89/505)[11]、13.3%(36/271)[14]、60.1%(492/818)[16]。而在西部地區(qū),目前對(duì)四川地區(qū)暫未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此,對(duì)四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況的調(diào)查,有利于了解四川地區(qū)奶牛賈第蟲(chóng)感染情況,同時(shí)也有利于研究賈第蟲(chóng)這類人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本研究結(jié)果表明,四川部分地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)總感染率為9.35%(26/278),較我國(guó)中部、東北、東南地區(qū)感染率低,與西北部分地區(qū)感染率接近,表明不同地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染率存在地區(qū)差異。本研究中,10個(gè)采樣地區(qū)有6個(gè)地區(qū)檢測(cè)出賈第蟲(chóng)陽(yáng)性(感染率0%~46.43%不等),表明不同養(yǎng)殖場(chǎng)的感染率仍存在差異。其原因可能與每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)密度、管理方式等因素有關(guān),且部分養(yǎng)殖場(chǎng)斷奶前犢牛通常未進(jìn)行分欄飼養(yǎng),以群養(yǎng)為主,增加賈第蟲(chóng)在奶牛之間的傳染概率[16]。

    目前國(guó)內(nèi)奶牛賈第蟲(chóng)感染主要以集聚體A和集聚體E為主,呈混合感染。根據(jù)不同的基因位點(diǎn),檢測(cè)出的基因型可能不同,因此在對(duì)某一地區(qū)進(jìn)行賈第蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定時(shí),常采用多位點(diǎn)基因鑒定以提高基因型鑒定、混合感染及序列多態(tài)性分析的準(zhǔn)確性[21]。目前,賈第蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定常采用包括16S rRNA、tpi、gdh和β-giaidin等[22]。之前研究表明,我國(guó)河南省、東北地區(qū)、寧夏回族自治區(qū)奶牛感染賈第蟲(chóng)以集聚體E為主[12,15,23],同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有集聚體A[12,23]、集聚體B感染[12,15]和集聚體A/E混合感染[12]。本研究基于bg、tpi和gdh三個(gè)基因位點(diǎn),對(duì)四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)感染情況進(jìn)行檢測(cè),分別擴(kuò)增出26、24,24條序列 ,經(jīng)序列比對(duì)鑒定,均為集聚體E,分別以E1(n=8)、E3(n=13),E1(n=9)基因亞型為主。提示四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)基因型與其他地區(qū)存在一定差異?;趖pi、gdh和β-giaidin基因位點(diǎn)均分別鑒定出7種亞型,并基于3種不同位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)了7種新基因亞型,表明四川地區(qū)賈第蟲(chóng)蟲(chóng)種的遺傳多樣性較高,各基因位點(diǎn)序列差異較大。

    本研究首次采用多位點(diǎn)基因序列分析法對(duì)四川部分地區(qū)犢牛賈第蟲(chóng)感染情況及基因分型進(jìn)行研究。四川地區(qū)斷奶前犢牛賈第蟲(chóng)主要以集聚體E為主。本次試驗(yàn)雖然未檢測(cè)出人獸共患集聚體A和B,但6個(gè)地區(qū)均檢測(cè)出集聚體E,表明四川地區(qū)犢牛感染賈第蟲(chóng)形勢(shì)仍然嚴(yán)重。在今后日常生產(chǎn)管理中,仍需加強(qiáng)奶牛的飼養(yǎng)管理,定期驅(qū)蟲(chóng),做好糞便處理工作,避免帶有感染性包囊的糞便污染水源及周邊環(huán)境。同時(shí),應(yīng)繼續(xù)對(duì)四川地區(qū)犢牛賈第蟲(chóng)感染進(jìn)行長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè),以確保家畜以及人類的健康。

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