Zip1 轉染骨髓間充質干細胞對Wnt1/β-catenin信號成骨通路的影響

章曉云 夏天 陳躍平 廖小林 袁振中 卓映宏 馮洋 藍佼 趙斌

1. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院創(chuàng)傷骨科與手外科，廣西 南寧 530001

2. 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001

必需微量元素鋅是機體多種酶的必需組分或激活因子，與機體發(fā)育、骨骼生長、免疫功能、內分泌調節(jié)、蛋白質和核酸代謝等一系列生理活動密切相關[1-2]。正常的鋅營養(yǎng)可以促進骨骼的健康發(fā)育，而鋅缺乏時，骨骼的生長會受到抑制，骨密度會降低。補充鋅能夠抑制或減輕一些神經細胞的凋亡[3]。相反，鋅缺乏能夠加重凋亡[4]。鋅離子代謝的穩(wěn)態(tài)平衡對維持機體正常生理功能至關重要。鋅離子不能自由通過細胞內的膜結構，必須通過特定的轉運蛋白和膜通道才可以在細胞內正常代謝。近年來的研究表明[5-6]，哺乳動物細胞內有一類蛋白質—-鋅轉運蛋白家族，可轉運鋅離子，并調節(jié)質膜內鋅離子濃度。鋅轉運體主要包括兩大類，即Slc30 a/ZnT家族和Slc39 a/ZIP家族，它們在鋅離子轉運過程中發(fā)揮了重要的作用。其中ZIP蛋白家族能夠促進鋅離子從細胞外或細胞器的內室涌入到細胞質中[7-8]。ZIP1作為ZIP蛋白家族的成員，其與骨代謝和成骨分化有密切的關系[9]。過表達ZIP1的BMSCs可以促進其向成骨細胞轉化[10-11]。因此，本研究以酒精性股骨頭壞死為模型，研究ZIP1轉染骨髓間充質干細胞對Wnt1/β-catenin信號成骨通路相關因子——堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)、骨鈣素(Osteocalcin OCN)、核心結合因子α1(Runt-related transcription factor 2， Runx2)以及I型膠原表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

隨機選擇10只成年健康雄性新西蘭兔，體質量2.8～3.4 kg，購自廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 實驗主要儀器及器材

紫外分光光度儀(Thermo scientific公司 美國)，高速冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)，倒置光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)，電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。ALP抗體與OCN 抗體(武漢BOSTER公司)，I型膠原抗體與Rux2抗體(英國abcam有限公司)，RIPA裂解液(北京天恩澤生物技術有限公司)，PBS緩沖液及DMEM-F12培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海博尚生物工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1兔原代骨髓間充質干細胞的提取、培養(yǎng)及傳代：將成年新西蘭兔全麻處理后，局部消毒后使用18號硬膜外穿刺針插入股骨髓腔，然后用5 mL注射器抽取含3000U/mL的肝素0.1 mL并將其注射進入髓腔，然后抽取2 mL左右骨髓血。用平衡液將骨髓血洗滌2次，然后用FBS培養(yǎng)液離心沉淀重新打勻。按1∶5的體積比將0.17 mol/L飽和NH4Cl溶液加入已重新打勻的懸液中，然后將其以800 r/min的轉速進行離心5 min；將上清液舍棄后，加入Ham f-12培養(yǎng)液調配后進行原代培養(yǎng)接種。將貼壁細胞用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液進行消化分離后，按照1∶3比例進行骨髓間質干細胞傳代培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，待貼壁細胞融合在一起直到培養(yǎng)孔的底面被完全覆蓋鋪滿。

1.3.2ZIP1 siRNA轉染骨髓間充質干細胞：將骨髓間充質干細胞以5×104個/孔的密度接種在六孔板上,充分搖勻，用含有青鏈霉素、PBS磷酸鉀緩沖液的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)3天后細胞融合度為40%，隨后進行轉染,轉染具體步驟如下：吸棄完全培養(yǎng)基，用PBS磷酸鉀緩沖液洗滌細胞2次，每孔加入1 mL 含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；用RNAase-free的去離子水溶解siRNA至終濃度為20 nmol/L，再將溶解后的siRNA溶于500 μL opti-MEM中，充分混勻，室溫下靜置5 min，標注為A管；另外將5 μL LipofectamineTMRNAiMAX 加入500 μL opti-MEM(堿血清培養(yǎng)基)中，輕輕混勻、靜置5 min，標注為B管；然后將A管稀釋好的siRNA和B管LipofectamineTMRNAiMAX輕輕混勻、靜置20 min，以便形成siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX復合物；再將siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX復合物分別加入到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板各孔中，來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板，最后將細胞放置在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育，孵育4 h～6 h后，吸棄轉染培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基；轉染后24 h，吸棄完全培養(yǎng)基，每孔加入1 mL Trizol。

1.3.3ZIP1表達載體轉染骨髓間充質干細胞： 轉染前一天對細胞株進行傳代培養(yǎng)，當細胞匯合度為70%～80%時再進行轉染，轉染采用Lipofectamine 2000轉染試劑，轉染時使用Opti-MEM；使用24孔板，每孔加入1 μL ZIP1表達重組質粒，稀釋到100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基標注為A液，取1 μL Lipofectamine 2000溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基為標注為B液，B液充分混合5 min后，再將A液和B液充分混合，常溫下放置20 min后平鋪到細胞培養(yǎng)板中，以上是每孔需要添加的量，孵育4 h～6 h后換為細胞生長培養(yǎng)基，36 h～48 h后進行收樣檢測。

1.3.4實驗分組及相關指標檢測：將兔骨髓間充質干細胞進行培養(yǎng)及傳代后，取第3代細胞，計數(shù)完畢后以1×104個/mL細胞濃度分別接種于6孔培養(yǎng)板中。將兔骨髓間充質干細胞分為3組，即空白對照組，模型組和轉染組?？瞻讓φ战M未做任何處理；模型組使用酒精濃度分別為0.03 mol/L，0.09 mol/L，0.15 mol/L，0.21 mol/L進行培養(yǎng)；轉染組使用ZIP1 siRNA轉染骨髓間充質干細胞后再用不同濃度乙醇進行培養(yǎng)，將各組均放在CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃)中進行培養(yǎng)6 h，每組重復實驗3次。收集培養(yǎng)板各孔細胞，進行裂解，提取細胞蛋白，采用Western-Blotting法測定各組細胞中ALP、OCN、Runx2以及I型膠原的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用均值±標準差對計量資料進行描述，使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對組間數(shù)據(jù)兩兩比較用LSD-t檢驗，多組間數(shù)據(jù)差異進行單因素方差分析檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長狀態(tài)

兔原代骨髓間充質干細胞提取常規(guī)培養(yǎng)1、2、3天細胞生長情況，可見細胞逐漸增多，形態(tài)變?yōu)榧氶L梭形。詳見圖1,2,3。

圖1 第1天，細胞較少，形態(tài)為梭形100xFig.1 On the first day, the cells were less and shuttle shaped

圖2 第2天，細胞逐漸增多，形態(tài)為長梭形100xFig.2 On the second day, the cells were gradually increasing and long shuttle shaped

圖3 第3天，細胞逐漸增多，較密集，形態(tài)為長梭形100xFig.3 On the third day, the cells were gradually increasing and denser, and were long spindle shaped

2.2 不同酒精濃度下骨髓間充質干細胞中ALP、I型膠原、OCN及Runx2的表達

與空白對照組相比，不同酒精組的ALP、I型膠原、OCN及Runx2蛋白表達量均有所下降，隨著濃度升高，其表達量逐漸下降，但0.03 mol/L組中ALP及OCN下降不明顯，統(tǒng)計學無明顯意義(P>0.05)，其他各組均有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)，不同酒精組中的I型膠原及Runx2與正常組之間差異均有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1及圖4。

表1 各組ALP、I型膠原、OCN及Runx2相對表達量的比較

注：與1組比較△P<0.05，▲P>0.05；與2組比較□P<0.05，■P>0.05；與3組比較☆P<0.05，★P>0.05；與4組比較◇P<0.05，◆P>0.05

Note: Compared with group 1,△P<0.05,▲P>0.05; Compared with group 2,□P<0.05,■P>0.05; Compared with group 3,☆P<0.05,★P>0.05; Compared with group 4,◇P<0.05，◆P>0.05

表2 各組中ALP、I型膠原及OCN相對表達量的比較

注：與對照組比較，**P<0.05；與過表達組比較，□P<0.05

Note: Compared with the control group,**P<0.05; Compared with ZiP1 group,□P<0.05

圖4 各組ALP、I型膠原、OCN及Runx2相對表達量柱狀圖(**:P<0.01;*:P<0.05. 與空白對照組相比)Fig.4 Relative expression of ALP, collagen type I, OCN, and Runx2 of each group in a bar graph (compared with the blank control group,**P<0.01;*P<0.05)

2.3 ZIPsiRNA和ZIP1轉染骨髓間充質干細胞對ALP、I型膠原及OCN的相對表達量的影響

與空白對照組對比，ZIP1表達組ALP、I型膠原及OCN表達量明顯升高，差異具有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ZIP1siRNA組ALP、OCN表達量明顯降低，差異具有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而I型膠原表達量下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與ZIP1siRNA組相比，ZIP1表達組ALP、I型膠原及OCN表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2及圖5。

圖5 各組蛋白相對表達量統(tǒng)計學比較柱狀圖(**P<0.05, 與對照組比較)Fig.5 Relative expression of ALP, collagen type I and OCN protein in each group in a bar graph (compared with the blank control group,** P<0.05)

3 討論

骨代謝是人體正常生理代謝過程中的重要組成部分，通過不斷進行骨組織的吸收與重建進行復雜的代謝過程，分為骨形成和骨吸收兩個方面。參與骨代謝的細胞主要有破骨細胞和成骨細胞，它們主要由骨髓間充質干細胞分化，而且骨髓間充質干細胞可以調節(jié)代謝過程中兩者之間的比例，從而維持骨吸收與重建之間的動態(tài)平衡。骨髓間充質干細胞作為一種多能間充質干細胞被大家共識，它具有多向分化能力，根據(jù)條件的改變向成骨細胞，脂肪細胞，成纖維細胞，軟骨細胞等分化，被廣泛應用于組織工程和再生醫(yī)學中[12，13]。

骨髓間質干細胞進行成骨分化的過程中需要多種特異性轉錄因子，而且可以合成與分泌多種特異性蛋白以及細胞外基質，如Runx-2、Osterix，ALP，OCN及I型膠原蛋白等[14，15]。其中Runx2因子是成骨分化過程中最重要的，它與成骨細胞特異性激活部分相結合，直接促使特異性基因(如ALP,OCN及I型膠原蛋白等)的表達，在骨代謝過程中起到調控作用[16]。ALP與OCN是骨再生早期及晚期的代表性因子，而I型膠原是骨代謝整個過程中的標志性因子，這三種因子的表達直接影響著骨代謝的整個過程[17，18]。骨髓間質干細胞促進成骨分化的能力直接影響骨折愈合，骨修復過程，促使其最大程度向成骨細胞轉化對于臨床上骨不連，酒精性股骨頭壞死的治療具有非常重要的作用。臨床大量研究表明[19-21]酒精在骨髓間質干細胞的定向分化過程中，通過降低ALP、OCN、Runx2，I型膠原含量抑制Wnt1/β-catenin信號成骨通路，而且隨著酒精濃度的提高而逐漸降低。大量實驗研究表明[22，23]在誘導骨髓間質干細胞成骨分化過程中，增加Wnt1/β-catenin信號通路表達活躍，同時ALP、OCN、Runx2，I型膠原等相關成骨基因的表達量也逐漸升高。本研究結果同樣也證明了隨著酒精濃度的升高，ALP、I型膠原、OCN及Runx2蛋白表達量均有所下降，從而影響股骨頭壞死的修復及治療效果。

隨著組織工程學及分子生物學飛速發(fā)展，越來越多的細胞因子被發(fā)現(xiàn)可以促使骨髓間質干細胞向成骨細胞轉化。雖然這些生長因子與蛋白能促進骨髓間充質干細胞成骨分化，但它們發(fā)生作用的過程中或多或少地受到人體微量元素的影響。同時ALP中有個重要的輔基是鋅離子，其活性受到鋅離子水平的影響，作為成骨分化過程中一個重要的蛋白酶，可見鋅可以通過調控基因表達從而促進骨髓間質干細胞的成骨分化。雖然鋅離子已經被證實對成骨作用有很好的促進作用，但是其仍然受到自身無法自由進出細胞內外的局限，它必須依靠特定轉運蛋白才能通過細胞膜通道從而完成其在細胞內的正常代謝。目前研究已證實ZIP蛋白家族具有調控和轉運鋅離子的功能[24，25]，ZIP1和鋅離子共同作用能抑制成骨細胞凋亡，促進成骨分化，ZIP1與骨代謝和成骨分化之間具有密切的關系[26，27]。本研究結果表明ZIP1過表達組ALP、I型膠原及OCN表達量顯著高于正常對照組及ZIP1干擾組，而ZIP1表達下降時，ALP及OCN表達量也明顯下降。實驗中發(fā)現(xiàn)ZIP1將細胞外的鋅離子通過細胞膜通道不斷的轉入細胞內，進入細胞內的鋅離子激活ALP、膠原酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶等與骨分化密切相關的鋅依賴性酶的活性，同時鋅離子的進入直接激活了鋅指蛋白的高表達，從而進一步促進成骨細胞轉錄因子Osterix的表達，最終使ALP、I型膠原及OCN合成顯著增加。本研究證實了ZIP1能促使骨髓間質干細胞向成骨分化，從而促進骨修復及骨代謝。沉默ZIP1表達能抑制骨髓間充質干細胞的Wnt1/β-catenin信號成骨通路的表達，從而抑制促進細胞的成骨分化能力。其具體機制可能是ZIP1通過鋅離子的轉運從而激活骨代謝相關的蛋白酶及轉錄因子，從而增加成骨相關因子ALP、I型膠原及OCN的合成與表達，最后促使骨髓間充質干細胞成骨分化，促進骨修復及骨代謝。