辣木發(fā)酵物對大鼠生長、骨骼代謝和骨密度的影響

劉佩佩 趙森 蔣羅昕 張京 徐維娜 徐建雄

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200240

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征致使骨骼脆性增加及骨折危險性增加的一種代謝性疾病，常見于老年人。全國第六次人口普查數(shù)據(jù)顯示，2010年60歲以上人口占全國人口13.26%，這個比例仍在提高[1]，隨著我國老齡化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥患者大幅度增加，對家庭、社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨密度(Bone mineral density，BMD)是診斷骨質(zhì)疏松和預(yù)測骨質(zhì)疏松骨折的重要手段[2]。鈣、磷是影響骨密度的主要營養(yǎng)因素，其中鈣與骨密度的關(guān)系非常的密切，足量鈣攝入是骨骼健康發(fā)育的基本保證和骨骼正常生長及形成峰值骨量的物質(zhì)基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究證明，鈣對峰值骨量起重要作用[3，4]。在骨組織內(nèi)磷構(gòu)成了骨骼最重要的無機(jī)成分，并且參與骨無機(jī)基質(zhì)與有機(jī)基質(zhì)形成的過程[5]。堿性磷酸酶是一種存在于除了高等植物外幾乎所有生物體內(nèi)的非特異性磷酸單酯酶，其活性是反映骨細(xì)胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的重要生化指標(biāo)[6]。

辣木是一種尚未充分開發(fā)的多功能樹種，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、栽培簡便及抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。辣木含有豐富的多種礦物質(zhì)、維生素和人體必需氨基酸，其中辣木葉、莖含有的VC是柑桔的6倍，VA是胡蘿卜的4倍，鈣和蛋白質(zhì)含量分別是牛奶的4倍和2倍[7]。據(jù)測定，新鮮辣木葉中鈣、磷含量分別為440mg/100g、70mg/100g[8]，干葉中鈣、磷含量更是高達(dá)2000.3mg/100g、228mg/100g[9]。研究證明，在飼料中添加辣木葉粉對提高肉雞脛骨完整性與脛骨骨無機(jī)成分有顯著效果[8]。辣木經(jīng)益生菌發(fā)酵后更能提高養(yǎng)分的利用率，辣木發(fā)酵物能否改善大鼠骨骼代謝，促進(jìn)大鼠骨密度還未見相關(guān)的報道。本試驗以辣木發(fā)酵物飼喂大鼠，觀察其對大鼠生長、腰椎骨密度和鈣磷代謝的影響，旨在為促進(jìn)骨骼生長，改善骨骼強(qiáng)度的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物、分組和飼養(yǎng)管理

24只4周齡健康清潔級雄性SD大鼠(體重74.38±0.63 g,購于上海杰思捷實(shí)驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2013-0006),按體重隨機(jī)分為兩組，兩組初始體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),每組3個重復(fù)，每個重復(fù)4只，分籠飼養(yǎng)。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%辣木發(fā)酵物，顆粒飼料，試驗期10周。

試驗方案通過上海交通大學(xué)動物管理委員會頒布的實(shí)驗動物使用和管理指南。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～25 ℃，相對濕度 50%～60%，光照明暗各 12 h，自由飲水與采食。

辣木發(fā)酵物由上海普緹康生物科技有限公司提供。辣木發(fā)酵物由辣木粉碎后經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵液(上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司生產(chǎn)，主要成分為乳酸桿菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌等)厭氧發(fā)酵而成。

1.2 樣品采集與測定

1.2.1體重與采食量：記錄實(shí)驗開始與結(jié)束時大鼠的體重、實(shí)驗周期中各組大鼠的采食量。

1.2.2血樣的采集與測定：試驗第10周，禁食24 h，按0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉后心臟取血，3 000 r/min離心15 min，取血清分裝于eppendorf管中，-80 ℃冷凍保存待測。

血清中鈣、磷含量分別采用鈣測定試劑盒(比色法)和磷測定試劑盒(磷鉬酸法)測定，堿性磷酸酶活性采用堿性磷酸酶測定試劑盒(微板法)測定。以上試劑盒均由南京建成生物研究所生產(chǎn)，操作嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3骨骼的采集與測定：(1)股骨長度和重量：采血后大鼠處死，分離左側(cè)后肢股骨，剔除表面肌肉與結(jié)締組織后，以游標(biāo)卡尺測量股骨長度，稱取股骨重(濕重)后，105 ℃烘干，稱重(干重)。

(2)腰椎骨密度：剝離并取下第2-第5腰椎骨(L2～L5)，剔干凈骨周邊肌肉，將紗布用生理鹽水沾濕，包裹住骨樣品，外面再包裹一層錫箔紙，防止水分蒸發(fā)，存放在-20 ℃冰箱備用，用于測定骨密度。從-20 ℃冰箱中取出腰椎骨(L2～L5)，室溫自然解凍，用Hologic Discovery A密度儀測定骨密度(BMD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。組間差異顯著性采用t檢驗，以P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為極顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠生長性能

試驗初期兩組大鼠體重上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，試驗期內(nèi)實(shí)驗組與對照組平均采食量無顯著變化(P>0.05)，試驗結(jié)束后實(shí)驗組大鼠體重顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 不同處理大鼠的體重和采食量(n=12)Table 1 The body weight and food intake of rats with different treatment (n=12)

注：與對照組比較，*P

Compared with control group, *P<0.05;**P<0.01.

2.2 大鼠股骨生長和腰椎骨密度

與對照組相比，實(shí)驗組大鼠股骨濕重提高了10%(P<0.05)，股骨干重提高了9.3%(P=0.05388),股骨長度增長了3.3%(P<0.01)。實(shí)驗組大鼠的L2～L5腰椎骨密度較對照組提高了8.03%(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 不同處理大鼠股骨生長和腰椎骨密度(n=12)Table 2 The growth of the femurs and the lumbar BMD of rats with different treatments (n=12)

注：與對照組比較，*P

Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01

3.3 血清Ca和P含量、血清堿性磷酸酶活性

與對照組相比，實(shí)驗組大鼠血清中Ca含量降低了18.4%，差異極顯著(P<0.01)，血清P含量顯著提高(P<0.05)。實(shí)驗組與對照組血清中堿性磷酸酶活性并無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 辣木發(fā)酵物對大鼠血中鈣、磷含量與堿性磷酸酶活性的影響(n=12)Table 3 The effect of fermented moringa on Ca content, P content, and alkaline phosphatase activity in rat (n=12)

注：與對照組比較，*P

Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01

4 討論

骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅中老年人健康的疾病之一。隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的加重，骨質(zhì)疏松癥將對家庭與社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此對骨質(zhì)疏松癥預(yù)防與治療的研究顯得十分重要。

辣木含有豐富的淀粉，蛋白質(zhì)，維生素A、B、C 以及礦質(zhì)元素，營養(yǎng)素全面，且適口性好。有實(shí)驗證明，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步外消化法測定多種熱帶或灌木的葉片蛋白質(zhì)的表觀消化率，發(fā)現(xiàn)辣木蛋白質(zhì)體外消化率最高，達(dá)79.2%[10]；在肉雞日糧中添加辣木葉粉，能改善仔雞免疫功能，對肉雞的增重和降低料肉比有顯著作用[11];Mohammed等[12]報道，用辣木鮮葉飼喂蛋雞發(fā)現(xiàn)能在一定程度上提高產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗中在基礎(chǔ)日糧中添加辣木發(fā)酵物對大鼠的采食量沒有明顯的作用，但大鼠增重有顯著提高，可能是辣木發(fā)酵物有提高大鼠的飼料轉(zhuǎn)化率、降低料肉比的功效，從而促進(jìn)了大鼠的生長。

辣木發(fā)酵物可促進(jìn)大鼠骨骼發(fā)育和骨骼強(qiáng)度。辣木具有高鈣高磷的特點(diǎn)，同時含有多種維生素，對骨骼骨質(zhì)增加、沉淀鈣磷有積極作用。另有報道，辣木葉中總黃酮含量高達(dá)46.17 mg/g[13]，黃酮類物質(zhì)能夠通過不同轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞生成、抑制破骨細(xì)胞分化，有提高骨密度與骨礦含量的作用[14]。有實(shí)驗證明，用灌胃法給SD大鼠飼喂添加不同濃度辣木葉粉的飼料，對大鼠血清堿性磷酸酶活性并無顯著影響[15]，這與本實(shí)驗結(jié)果一致。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組大鼠血清磷含量提高，而血清鈣水平降低。磷作為動物體生長重要的礦物元素，有著形成和維持骨骼組織、影響血鈣的吸收沉積等作用，而辣木含有豐富的鈣(辣木干葉中鈣、磷含量分別為2000.3 mg/100 g、228 mg/100 g)，且辣木鈣磷易吸收。Thobela Nkukwana[8]發(fā)現(xiàn)飼料中添加辣木葉粉對提高肉雞脛骨完整性與脛骨骨無機(jī)成分有顯著效果，本實(shí)驗飼喂辣木發(fā)酵物后大鼠血清鈣降低可能是由于血鈣大量沉積于骨骼所致，實(shí)驗組大鼠股骨重量、長度和腰椎骨密度顯著提高的結(jié)果也印證了該推測。

綜上所述，生長期大鼠日糧中添加辣木發(fā)酵物可顯著促進(jìn)大鼠生長發(fā)育，促進(jìn)大鼠骨骼中鈣的沉積和骨骼生長，提高骨骼強(qiáng)度。