電針對去卵巢大鼠骨密度及生物力學(xué)的影響

王亞軍 張來舉 宋凱 浪萬英 宋亞文

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)多發(fā)生在絕經(jīng)后婦女，由于卵巢功能衰退，雌激素水平降低，導(dǎo)致骨量減少及骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化、骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身代謝性骨病[1-3]。PMO引起的骨痛、骨骼變形及出現(xiàn)合并癥嚴(yán)重影響老年人的身體健康和生活質(zhì)量，PMO的危害及防治已成為當(dāng)今熱點(diǎn)問題之一。當(dāng)前PMO的治療主要以藥物為主，但大多存在價(jià)格昂貴、副作用大、長期耐受性差等問題[4，5]。近年來，針灸療法在治療PMO的臨床和實(shí)驗(yàn)研究中取得了一定進(jìn)展，并以其安全簡便、無不良反應(yīng)和療效顯著等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視，但在療效評價(jià)和治療機(jī)制方面仍存在許多未解決的問題[6,7]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度、生物力學(xué)的影響，探討該法對PMO在骨質(zhì)改善方面的療效為其機(jī)理的研究提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取60只SPF級雌性SD大鼠，日齡60 d左右，體質(zhì)量180～220 g，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度50%～70%，飲用純凈水，食用標(biāo)準(zhǔn)鼠類飼料，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研動物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號：SCXK(甘)2011-0001)，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：62001000000276。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、電針組，各12只。

1.2 藥物及主要儀器

戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，生產(chǎn)批號：199A3)；水合氯醛(保定市凌業(yè)商貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號：G3045)；針灸針(Ф0.35×13 mm，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司，型號SDZ-Ⅱ)；Prodigy DXA (GE公司，美國)；AGS-J系列精密電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1骨質(zhì)疏松模型建立：按照文獻(xiàn)[8]方法造模:將模型組、藥物組、電針組大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，腹位固定，在其最末肋骨下，腋中線與距脊柱外側(cè)約1 cm交叉處備皮、消毒，切開皮膚約1～1.5 cm，依次切開肌肉，剪開腹膜進(jìn)入腹腔，用小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，便可見到粉色菜花樣卵巢，先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除雙側(cè)卵巢，觀察無異常后，切口分層縫合，外部敷以消炎粉?？瞻捉M不做任何處理，假手術(shù)組只暴露雙側(cè)卵巢但不切除。造模后飼養(yǎng)13周，去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型成功建立并開始進(jìn)行治療干預(yù)。

1.3.2干預(yù)方法:電針組選取“腎俞”、“脾俞”、“三陰交”、“足三里”，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]類比取穴，將大鼠穴位局部剪去鼠毛，穴位和針具常規(guī)消毒后，用0.35×13 mm不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針儀，頻率為2 Hz，斷續(xù)波，刺激強(qiáng)度1.0mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳[10,11]，每次電針刺激15 min，1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d，20 d為1個(gè)療程，治療3療程，同時(shí)灌服與藥物組相同體積的蒸餾水；藥物組大鼠給予1 mL/100 g體質(zhì)量的0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液灌胃(給藥劑量按照大鼠體表面積比值折算得來)[8,12]，療程同電針組；空白組不予處理，常規(guī)飼養(yǎng)；模型組、假手術(shù)組大鼠灌服與藥物組相同體積的蒸餾水，療程同電針組。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1離體骨組織BMD檢測:治療期滿3個(gè)療程后用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉并處死，分離出椎骨和股骨，剝除附著的軟組織，用經(jīng)生理鹽水浸透的醫(yī)用紗布包裹左側(cè)股骨和椎骨，放置于-20 ℃冰箱中保存待用。使用雙能X線BMD儀(DXA)檢測左側(cè)股骨和腰椎的BMD，將解凍后的骨樣本整齊的擺放在檢測床上開始檢測，結(jié)果用g/cm2表示。

1.4.2生物力學(xué)檢測:三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)：將檢測完BMD的左側(cè)股骨用AGS-J系列精密電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)檢測最大載荷和彈性模量。具體方法:將股骨頭凹面朝下，股骨頭端朝前的位置放置于跨距為17 mm的兩個(gè)支撐點(diǎn)上，壓頭大概在股骨長度中間位置的正上方給標(biāo)本施加向下10 mm/min的載荷，直至股骨斷裂，最后記錄并計(jì)算最大載荷和彈性模量，股骨斷裂前所能承受的最大力為最大載荷，股骨斷裂時(shí)所承受的力為斷裂載荷。

壓縮試驗(yàn):將檢測完BMD的椎骨分離出第4腰椎，剝除椎體上附著的軟組織，將徹底融化后的第四腰椎的上下兩側(cè)用砂紙打磨平整，放置在加載平臺上，加載方向和椎體生理方向保持一致放置于加載平臺上。壓頭向下給標(biāo)本施加以10 mm/min的加載速度，直至椎體碎裂后，記錄并計(jì)算最大載荷和彈性模量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠股骨、腰椎BMD測定結(jié)果

如表1所示：與假手術(shù)組比較，模型組骨密度顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組與藥物組大鼠BMD顯著增高(P<0.01)；電針組與藥物組大鼠BMD相比假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)，提示針刺能夠顯著提高去卵巢大鼠骨密度，但未恢復(fù)到正常水平。

表1 各組大鼠股骨、腰椎BMD骨密度檢測結(jié)果

注: 與假手術(shù)組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較,▲P<0.01，▲▲P<0.01

Notes:*P<0.05,**P<0.01, compared with sham operation group;▲P<0.01,▲▲P<0.01, compared with model group

2.2 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示：與假手術(shù)組比較，模型組彈性模量、最大載荷顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，藥物組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高(P<0.01)，電針組彈性模量、最大載荷明顯增高(P<0.01)，電針組與藥物組大鼠彈性模量、最大載荷相比假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)，提示針刺干預(yù)后大鼠彈性模量、最大載荷雖有提高但未恢復(fù)到正常水平。

2.3 壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠彈性模量、最大載荷顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，藥物組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高(P<0.01)；電針組大鼠彈性模量、最大載荷明顯增高(P<0.01)，電針組與藥物組大鼠彈性模量、最大載荷相比假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)，提示針刺干預(yù)能夠顯著提高去卵巢大鼠彈性模量、最大載荷，但未恢復(fù)到正常水平。

表2 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果

注: 與假手術(shù)組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較,▲P<0.01，▲▲P<0.01

Notes:*P<0.05,**P<0.01, compared with sham operation group;▲P<0.01,▲▲P<0.01, compared with model group

表3 各組大鼠第4腰椎壓縮試驗(yàn)結(jié)果

注: 與假手術(shù)組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較,▲P<0.01，▲▲P<0.01

Notes:*P<0.05,**P<0.01, compared with sham operation group;▲P<0.01,▲▲P<0.01, compared with model group

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨藏精，腎精對骨的發(fā)生、成長及退化起著重要作用；脾主四肢，歸百骸之母，氣血生化之源，脾化生精微借助于腎陽的溫煦，而腎中精氣依賴于水谷精微的充養(yǎng)，兩者相互滋養(yǎng)，互為因果，脾虛可導(dǎo)致腎虛及骨髓空虛，從而引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生。故PMO的基本病機(jī)是脾腎痿虛、骨枯髓痿為本、邪阻經(jīng)絡(luò)為標(biāo)，當(dāng)以補(bǔ)腎健脾，輔以通絡(luò)為治療原則[13，14]。脾俞穴、腎俞穴具有健脾補(bǔ)腎的作用，三陰交為肝脾腎三經(jīng)的交會穴，可補(bǔ)益三臟之虛，足三里為胃之下合穴有健脾和胃、扶正培元、通經(jīng)活絡(luò)、升降氣機(jī)的功用，為全身強(qiáng)壯要穴，諸穴相配可有效改善PMO的臨床癥狀，從而達(dá)到較好的治療效果。

據(jù)統(tǒng)計(jì)[15-17]，PMO導(dǎo)致骨折的主要部位在股骨、盆骨和腰椎等處，因股骨、盆骨和椎骨起主要的支撐和受力的作用，50歲以上的中年婦女股骨和椎骨的骨量丟失最為嚴(yán)重，該部位發(fā)生骨折的可能性也最大。因此在探索PMO治療手段的過程中，對于動物模型的研究重點(diǎn)也更側(cè)重于對股骨和椎骨的研究。

骨密度常作為全面評價(jià)PMO骨強(qiáng)度和預(yù)測骨折危險(xiǎn)性的一個(gè)可靠指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過DXA檢測大鼠左側(cè)股骨和腰椎的BMD，結(jié)果顯示模型組大鼠BMD與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.01)，這說明PMO模型復(fù)制成功，電針組與藥物組大鼠BMD相比假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)，提示針刺能夠顯著提高去卵巢大鼠骨密度，但未恢復(fù)到正常水平。經(jīng)過3個(gè)療程的干預(yù)，電針組，藥物組大鼠BMD比模型組明顯增高(P<0.01)；其中藥物組效果最佳，說明該模型造成了雌激素下降，故對應(yīng)用戊酸雌二醇治療反應(yīng)性較好，表明形成骨質(zhì)疏松模型是由于雌激素的下降導(dǎo)致的。電針組BMD明顯升高，這表明給予針刺治療對改善機(jī)體PMO的BMD丟失有著積極作用，本研究從動物實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證了針刺對BMD的療效。

有學(xué)者[18]提出PMO發(fā)生時(shí)有骨量的流失與骨結(jié)構(gòu)的改變，均可直接影響骨的生物力學(xué)性能，使骨的力學(xué)強(qiáng)度降低。因此檢測骨的生物力學(xué)性能的變化，可作為評價(jià)PMO及治療有效性的一個(gè)重要指標(biāo)，也是反映和評價(jià)骨質(zhì)量最有說服力的指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)采用股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)和椎骨壓縮試驗(yàn)來檢測相關(guān)骨組織生物力學(xué)性能，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示模型組彈性模量、最大載荷比假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，藥物組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高(P<0.01)；電針組彈性模量、最大載荷明顯增高(P<0.01)；與假手術(shù)組比較電針組與藥物組比較有明顯性差異(P<0.01)。第4腰椎壓縮試驗(yàn)結(jié)果顯示模型組彈性模量、最大載荷比假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，電針組、藥物組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高(P<0.01)；電針組、藥物組與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01)。提示針刺和藥物干預(yù)后都可以使大鼠骨組織生物力學(xué)性能升高，兩者療效相當(dāng)，但都未恢復(fù)到正常水平。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)以往的研究結(jié)果[19-20]：針刺對去卵巢大鼠BMD和生物力學(xué)性能都有很好的改善，但還未達(dá)到正常水平，我們考慮：(1)可能由于PMO是一個(gè)長期形成的過程，治療也同樣需要長期的過程，因此，今后的研究可考慮采用更長的研究周期，這樣能更好地突顯針刺的治療效果；(2)說明骨代謝疾病存在不可逆性，所以其預(yù)防比治療意義更加重大。針灸的療效具有整體性、多維度、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)，因此療效的評估除了骨密度和生物力學(xué)外，還應(yīng)該對針刺治療產(chǎn)生的全身的、整體的調(diào)節(jié)作用給予深入探究。