自噬對(duì)骨質(zhì)疏松癥骨代謝的影響研究

萬永鮮 徐麗麗 卓乃強(qiáng) 陽(yáng)運(yùn)康 魯曉波

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000

原發(fā)性骨質(zhì)疏松是一類與年齡密切相關(guān)的骨骼系統(tǒng)退行性疾病，在人口老齡化的當(dāng)今社會(huì)，其發(fā)病率日益增高。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，在50歲以上人群中有1/3的女性和1/6的男性均罹患骨質(zhì)疏松癥[1]。骨質(zhì)疏松癥是由多因素導(dǎo)致的骨密度和骨質(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身骨代謝疾病[2]。骨折是骨質(zhì)疏松癥最常見的并發(fā)癥，而老年人骨折后容易因?yàn)樘弁春凸δ苷系K失去自理能力。由此導(dǎo)致的高致殘率和高死亡率，使得骨質(zhì)疏松癥成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題。因此防治骨質(zhì)疏松癥有著巨大的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。

骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，通常認(rèn)為與基因、激素水平、營(yíng)養(yǎng)飲食以及人們的生活習(xí)慣密切相關(guān)[3]。正常成年人往往會(huì)在三十歲左右獲得“骨峰值”，然后在內(nèi)外因素的作用下漸漸丟失骨量[4, 5]。如缺乏體育鍛煉、長(zhǎng)期使用類固醇激素治療、雌激素缺乏、罹患慢性代謝系統(tǒng)疾病，以及衰老本身，將最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。揭示骨代謝的調(diào)控機(jī)制，尋找其作用靶點(diǎn)是有效治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵所在。

近年來越來越多的證據(jù)表明，自噬在維持骨代謝平衡方面發(fā)揮著重要作用，而自噬水平的改變是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要原因[6, 7]。自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)以及分子伴侶介導(dǎo)自噬(chaperone-mediated autophagy)，是一種通過清除受損細(xì)胞器、蛋白從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理機(jī)制。盡管自噬對(duì)骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控機(jī)制尚不明確，但其作為一種人體干預(yù)疾病和調(diào)控衰老的手段，自噬對(duì)骨代謝的影響與作用正在不斷被揭示。本文主要對(duì)巨自噬(下文以“自噬”指代)在骨代謝中的研究進(jìn)展探討如下：

1 骨代謝概述

圖1 自噬發(fā)生過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of autophagy process

骨是由多種細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜器官，主要包括負(fù)責(zé)骨形成的成骨細(xì)胞、骨吸收的破骨細(xì)胞，以及位于成熟骨組織內(nèi)的骨細(xì)胞[8]。在正常情況下，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞協(xié)同作用，共同維持骨重建與骨吸收平衡。從細(xì)胞水平的病理機(jī)制而言，成骨和破骨能力間的平衡被破壞，骨吸收占優(yōu)后導(dǎo)致了骨質(zhì)流失，最終演化為骨質(zhì)疏松。成骨細(xì)胞源于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesennchymal stem cell, MSC)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞，在向成骨分化時(shí)需要誘導(dǎo)因子，如骨形態(tài)誘導(dǎo)蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、Wnt分子、胰島素、甲狀旁腺激素等。這些因子通過激活不同的信號(hào)通路從而活化不同轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮維護(hù)成骨細(xì)胞功能的作用。目前研究比較明確的是，當(dāng)細(xì)胞高表達(dá)Runx2和Osterix時(shí)，MSCs會(huì)更傾向于成骨分化[9]。更為重要的是成骨細(xì)胞可以產(chǎn)生破骨細(xì)胞的調(diào)控因子，如起正向調(diào)控作用的NF-κB配體的受體激活因子RNAKL，和起負(fù)向調(diào)控作用的骨保護(hù)素(osteoprotegrin, OPG)。而破骨細(xì)胞則主要起源于造血細(xì)胞源的單核前體細(xì)胞，通過融合形成一種直徑20～100 μm，含有多個(gè)細(xì)胞核，胞漿富含細(xì)胞器的不規(guī)則細(xì)胞[10]。 如前所述，成骨細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, M-CSF)與受體分子c-Fms結(jié)合能誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞增殖。此外RANKL與NF-κB受體活化因子(RANK)結(jié)合，能激活參與誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的主要轉(zhuǎn)錄因子，如活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)，該因子與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用后，可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞特異性基因(抗酒石酸酸性磷酸酶，降鈣素受體和組織蛋白酶K等)的表達(dá)[11]。

目前認(rèn)為主要參與骨合成代謝的信號(hào)傳導(dǎo)通路有MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路、Notch信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、BMPs信號(hào)通路、PPAR-γ信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路等[12]；而骨吸收代謝則主要受OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路、TNF-α信號(hào)通路、MITF信號(hào)通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路等調(diào)控[13]。由此可見骨骼系統(tǒng)作為一個(gè)代謝活躍的器官，受到眾多生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。通過多種細(xì)胞因子的相互作用，信號(hào)通路正負(fù)反饋調(diào)控，重新恢復(fù)成骨與破骨的平衡，是今后預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的一個(gè)重要思路。

2 自噬概述

巨自噬的一大特征是包含有雙層膜結(jié)構(gòu)組成的自噬體(autophagosome)，自噬體中包被胞漿成分，如折疊錯(cuò)誤的蛋白，受損的線粒體等，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autophagolysosome)，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)在環(huán)境的更新與能量補(bǔ)充[14]。所有細(xì)胞中均存在一定程度的基礎(chǔ)自噬，用于維持細(xì)胞穩(wěn)定的基本功能。而當(dāng)細(xì)胞收到外界應(yīng)激，或內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)和能量需求上升時(shí)，自噬將被激活[15]。自噬的激活過程主要分為以下四個(gè)部分：① 細(xì)胞接受到自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞漿內(nèi)形成一個(gè)雙層的“類脂質(zhì)體”膜結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為吞噬泡(phagophore)；② Phagophore不斷延伸，在特定信號(hào)誘導(dǎo)下將受損蛋白、細(xì)胞器等納入，并形成一個(gè)密閉的球狀autophagosome，即自噬體。電鏡下自噬體有其特征性結(jié)構(gòu)：一為雙層膜，二是內(nèi)含吞噬的胞漿成分；③ 自噬體形成后，可與細(xì)胞內(nèi)的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合(但并不一定發(fā)生)；④ 自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，自噬體所包含的內(nèi)容物被溶酶體中的酶降解，其產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)又被重新輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用、或被排除細(xì)胞外。

與自噬相關(guān)的信號(hào)通路主要有mTOR信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、ROS信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等[16]。近年來越來越多研究表明，自噬及其相關(guān)信號(hào)通路在骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中扮演著重要角色，有望為其治療提供新的思路。

3 自噬對(duì)骨代謝的影響

在一般病理?xiàng)l件下，骨吸收和骨形成平衡被打破是骨質(zhì)疏松癥的根源所在，而自噬在骨代謝相關(guān)細(xì)胞的退變過程中均起到重要作用[17]。骨細(xì)胞是骨基質(zhì)中的一種長(zhǎng)壽細(xì)胞，因此隨著年齡增長(zhǎng)，骨細(xì)胞會(huì)比破骨或成骨細(xì)胞積累更多的分子水平損害。而自噬可以幫助清除骨細(xì)胞內(nèi)損壞的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)大分子等，從而減少衰老對(duì)骨細(xì)胞功能的負(fù)面影響[18]；成骨細(xì)胞是促進(jìn)骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，其自噬活性的降低會(huì)導(dǎo)致骨形成減少、骨骼質(zhì)量下降，并最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生[19]；破骨細(xì)胞主要參與骨質(zhì)吸收，與成骨細(xì)胞的作用相輔相成，有研究報(bào)道[20]糖皮質(zhì)激素可以通過自噬誘導(dǎo)破骨細(xì)胞產(chǎn)生，而抑制破骨細(xì)胞自噬則可以阻止破骨細(xì)胞成熟，減弱骨質(zhì)疏松的程度。由此可見自噬在各個(gè)環(huán)節(jié)均參與了骨的代謝，自噬紊亂導(dǎo)致了成骨和破骨平衡的失調(diào)，從而導(dǎo)致了骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

3.1 自噬對(duì)骨細(xì)胞的影響

骨細(xì)胞是一種定居在骨的礦物基質(zhì)中的長(zhǎng)壽細(xì)胞，其處于一個(gè)缺氧的微環(huán)境中，因此更容易受到氧化應(yīng)激的影響。研究表明在這種惡劣的微環(huán)境下，自噬激活是保護(hù)其生存的一個(gè)重要生理機(jī)制[21]。體外的一項(xiàng)模擬體內(nèi)環(huán)境的研究表明，在營(yíng)養(yǎng)剝奪或低氧狀態(tài)下，類骨細(xì)胞可以提高自噬水平以抵抗凋亡[22, 23]。此外，在一項(xiàng)鈣離子誘導(dǎo)的應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducing transcription factor, HIF-1)可以作為自噬的調(diào)節(jié)劑來應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境。低劑量的糖皮質(zhì)激素可以引起骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激，而被激活的自噬作為一種代償機(jī)制可以起到明顯的保護(hù)作用[24]。

3.2 自噬對(duì)成骨細(xì)胞的影響

當(dāng)成骨細(xì)胞進(jìn)入骨基質(zhì)后，轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞的過程中自噬發(fā)揮著重要作用。在這一轉(zhuǎn)化過程中，成骨細(xì)胞在形態(tài)上會(huì)發(fā)生明顯改變，同時(shí)內(nèi)在細(xì)胞器的大小和數(shù)目也會(huì)發(fā)生變化。已有研究證實(shí)在成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，細(xì)胞內(nèi)的自噬水平明顯提高[25]。其潛在的原因在于激活的自噬為細(xì)胞提供了更高效的細(xì)胞器更新以及額外的營(yíng)養(yǎng)能量支持，同時(shí)胞漿中的肌動(dòng)蛋白變得更為豐富，以此來適應(yīng)基質(zhì)中的低氧微環(huán)境。事實(shí)上，研究也證實(shí)自噬的標(biāo)記物L(fēng)C3在骨細(xì)胞中表達(dá)比在成骨細(xì)胞中明顯提高，意味著自噬水平更高。此外，體外細(xì)胞學(xué)研究表明通過藥物抑制自噬后，成骨細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平會(huì)提高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；而激活自噬可以明顯抑制由氧化應(yīng)激所引起的凋亡[26]。同樣雌激素可以通過提高自噬從而抑制成骨細(xì)胞的凋亡[27]。

3.3 自噬對(duì)破骨細(xì)胞的影響

近年來，越來越多的研究證明自噬相關(guān)蛋白參與了破骨細(xì)胞的分化、形成過程。有證據(jù)表明當(dāng)加入了自噬的一種特異性抑制劑Bafilomycin后，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收被明顯抑制[28]。在一項(xiàng)老鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，人為的將P62基因突變后，老鼠表現(xiàn)出與Paget’s病類似的癥狀，即過度的骨轉(zhuǎn)化容易發(fā)生骨折[28]。此外，在糖皮質(zhì)激素作用介導(dǎo)的低氧和氧化應(yīng)激作用下，在破骨形成的過程中自噬水平始終高表達(dá)[29]。這些結(jié)果均提示了自噬作為一種保護(hù)性機(jī)制可以促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，以及維持其在各種應(yīng)激狀態(tài)下的生存。

3.4 自噬與骨質(zhì)疏松關(guān)系

最新的一項(xiàng)動(dòng)物研究表明，在單核細(xì)胞中通過氯喹或選擇性的敲除自噬相關(guān)基因(Atg7)，降低自噬后可以抑制破骨細(xì)胞形成從而減少骨量丟失[30]。相對(duì)應(yīng)的，高劑量的糖皮質(zhì)激素處理可以降低LC3陽(yáng)性的成骨細(xì)胞，從而減弱成骨活性。而采用硬化骨蛋白(sclerostin)抗體治療后，可以通過激活自噬從而減少由糖皮質(zhì)激素所誘導(dǎo)的骨流失[31]。由此可見自噬對(duì)于骨量的維持非常重要。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其作用，通過敲除大鼠成骨細(xì)胞中的FIP200基因(介導(dǎo)自噬體形成的關(guān)鍵基因)后發(fā)現(xiàn)，這些實(shí)驗(yàn)大鼠非常容易罹患骨量減少或骨質(zhì)疏松。但對(duì)于老年大鼠，通過喂飼自噬的激動(dòng)劑雷帕霉素，可以顯著減輕其骨質(zhì)疏松的癥狀。

這些研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面均有力地證明了自噬不足與骨質(zhì)疏松發(fā)病之間的關(guān)系。但在人體研究而言，這方面的證據(jù)還十分有限。在一項(xiàng)納入984名志愿者的基因芯片掃描研究中發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)的調(diào)控基因是唯一與橈骨遠(yuǎn)端骨密度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)性的指標(biāo)。這一結(jié)果也暗示自噬信號(hào)通路在人類骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中或許發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[32]。

圖2 自噬與骨代謝關(guān)系示意圖Fig.2 The relationship between autophagy and bone metabolism

4 小結(jié)

綜上所述，在體外與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已充分證實(shí)了自噬與骨代謝之間的關(guān)系，即自噬的紊亂會(huì)引起成骨和破骨平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。在今后的研究中，需要進(jìn)一步在人體中明確自噬在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的作用，以期找到新的治療靶點(diǎn)，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路。