骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠下頜骨顯微結(jié)構(gòu)及最大載荷的影響

曾輝 趙許兵 徐紅艷 左艷萍 周芳

1. 西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，陜西 西安 710021 2. 西安交通大學口腔醫(yī)學院急特診科，陜西 西安 710004 3. 陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068

骨質(zhì)疏松是影響超過20%50歲以上女性的一種普遍病理狀況[1]。骨質(zhì)疏松癥的主要特征包括骨礦密度降低、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞，以致骨的脆性增加，骨折危險性增高[2]。研究顯示，絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥可明顯累及下頜骨，頜骨骨質(zhì)喪失是骨質(zhì)疏松在口腔頜面部的局部表現(xiàn)[3]。頜骨骨質(zhì)疏松可加重牙周炎骨吸收，使牙齒缺失率增加[4]，同時，頜骨密度降低也影響牙種植體早期骨整合[5]，是影響牙種植體成功的危險因素之一。目前，對全身骨質(zhì)疏松有改善作用的藥物對頜骨結(jié)構(gòu)、骨量等的作用如何，已成為研究熱點[6]。骨碎補總黃酮是從中藥骨碎補中提取出來的最主要的一種黃酮成分。研究表明，骨碎補總黃酮可增加骨質(zhì)疏松大鼠股骨和腰椎的骨密度，改善骨顯微結(jié)構(gòu)[7]，并已初步運用于臨床骨質(zhì)疏松癥的輔助治療[8]。本項研究擬將骨碎補總黃酮以全身用藥的方式給予去勢雌性大鼠，從下頜骨骨量(骨密度)、下頜骨微結(jié)構(gòu)和最大載荷三個方面探討骨碎補總黃酮對頜骨骨質(zhì)疏松的改善作用，以期為骨碎補總黃酮防治頜骨骨丟失的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

40只3月齡雌性未孕SD大鼠(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重(230±30)g。自由飲水，分籠飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)一周后，按體重對等原則隨機分為5組：假手術(shù)組(Sham)、去卵巢模型組(OVX)、戊酸雌二醇組(EV)、骨碎補總黃酮低劑量組(GB-L)和骨碎補總黃酮高劑量組(GB-H)，每組8只，實驗過程中無動物死亡。

1.2 實驗藥物與試劑

骨碎補總黃酮(中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院和四川中藥研究所研制，批號961214)，使用時加滅菌水制成一定濃度溶液(0.46 g/L)灌胃治療。戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號20130009)。水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)。顯微CT儀(Inveon, Siemens, Germany)，日本島津自動控制萬能試驗機(AG-IC型號)，超純水儀(Milipore，F(xiàn)rance)。

1.3 大鼠下頜骨骨質(zhì)疏松模型造模與給藥

Sham組僅切除雙側(cè)卵巢附近脂肪組織，其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。10%水合氯醛按0.38 mL/100 g體重，腹腔注射，對大鼠進行麻醉。將大鼠固定于手術(shù)臺上，在背部1/3處剪毛，用碘酊、酒精局部消毒皮膚，取腰椎后側(cè)正中切口，鈍性分離肌肉組織，可見位于兩側(cè)腎臟外下方呈淡粉紅色的卵巢及子宮，在子宮角上作兩個結(jié)扎后切斷子宮角，將卵巢完整摘除后撒上青霉素粉，縫合皮膚，消毒傷口。術(shù)后一周對建模大鼠進行陰道涂片，連續(xù)5 d，觀察去卵巢大鼠不出現(xiàn)動情周期，表明去除卵巢成功。術(shù)后3個月，各組大鼠進行灌胃治療。

GB-H組灌胃給予骨碎補總黃酮216 mg/(kg·d)，GB-L組灌胃給予骨碎補總黃酮108 mg/(kg·d)，EV組灌胃給予戊酸雌二醇0.1 mg/(kg·d)，Sham組和OVX組給予等計量的生理鹽水，連續(xù)服藥12 w。

1.4 下頜骨骨密度測量

各組大鼠灌胃治療12 w后過量麻醉處死，取大鼠左側(cè)下頜骨并剝離附著在上面的軟組織，凍存于-80 ℃冰箱中備用，測量前于室溫下解凍。將大鼠下頜骨置于Micro-CT掃描球管中進行正位掃描，采用手動分析模式測定下頜骨骨密度。骨密度以骨量/骨投影面積(g/cm2)表示。

1.5 下頜骨Micro-CT定量參數(shù)測量

將處理好的下頜骨標本沿長軸垂直固定于樣品固定器內(nèi)，選擇掃描參數(shù)：掃描方式360°旋轉(zhuǎn)，電壓80kV，電流80μA。圖像矩陣為1024×1024，曝光時間2 960 ms。掃描完成后，如圖1所示，選取第二磨牙近中根的近中至第三磨牙遠中根的遠中根尖1/3區(qū)的骨組織為感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)行三維重組。獲得重組圖像后，使用Mirco-CT自帶軟件進行定量分析。各測量分析參數(shù)及意義見表1。

1.6 下頜骨最大載荷測量

各組大鼠灌胃治療12 w后過量麻醉處死，將右側(cè)下頜骨關(guān)節(jié)端及切牙端包埋于樹脂當中，下頜磨牙區(qū)暴露，樹脂塊底部與地平面平行，置于日本島津自動控制萬能試驗機測試，加載點為下頜第二磨牙處，跨距為20 mm，加載速度為0.5 N/min，逐漸加力，直至骨完全斷裂，實驗中用生理鹽水噴灑下頜骨表面，保持濕潤。

注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠下頜骨骨密度測量結(jié)果

各組大鼠下頜骨骨密度測量結(jié)果見表2。由表2可以看出，OVX組與Sham組相比，下頜骨密度顯著降低(P<0.05)。EV組干預治療12 w后，已有明顯的修復作用，與Sham組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GB-H組干預治療12 w后，下頜骨骨密度雖未恢復至正常水平，但骨密度已比OVX組顯著提高(P<0.05)；GH-L組下頜骨骨密度雖有一定程度增加，但與OVX組相比尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

組別樣本量骨密度Sham81.118±0.006# OVX80.797±0.041? EV81.108±0.013# GB-L80.909±0.027? GB-H81.013±0.033?#

注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05

2.2 各組大鼠下頜骨Micro-CT三維測量結(jié)果

圖1 各組大鼠下頜骨顯微結(jié)構(gòu)圖，紅色區(qū)域為顯微CT目標分析區(qū)域A:假手術(shù)組；B:去卵巢模型組；C：戊酸雌二醇組；D：骨碎補總黃酮低劑量組；E：骨碎補總黃酮高劑量組Fig.1 Micrographs of the vertical section of mandible in rats of different groups. The red area is the micro-CT target analysis area. A: Sham group; B: OVX group; C: EV group; D: GB-L group; E: GB-H group.

各組大鼠下頜骨骨組織的感興趣區(qū)行三維重組后得出三維測量結(jié)果(表3，圖1)。由表3可知，OVX組與Sham組相比，下頜骨BV/TV下降56.6%，Tb.Th、Tb.N顯著降低(P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp則明顯增加(P<0.05)，骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與OVX組比較，EV組大鼠下頜骨BV/TV顯著上升(P<0.05)，Tb.Th、Tb.N顯著增加(P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp顯著減小(P<0.05)，骨微結(jié)構(gòu)得到良好修復，已與Sham組無明顯差異(P>0.05)。與OVX比較，GB-H組的BV/TV上升41.6%，Tb.N增加42.2%，BS/BV、Tb.Sp顯著減小(P<0.05)，Tb.Th尚未顯示出統(tǒng)計學差異，以上結(jié)果顯示高劑量的骨碎補總黃酮對下頜骨微結(jié)構(gòu)有一定程度的改善作用。與OVX組比較，GB-L組BV/TV上升20%，Tb.N增加24%，Tb.Sp顯著減小(P<0.05), Tb.Th、BS/BV無明顯改變(P>0.05)，實驗結(jié)果顯示低劑量的骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)有一定改善趨勢，但效果不及高劑量組。

2.3 各組大鼠下頜骨最大載荷測量

如表4所示，與Sham組比較，OVX組大鼠下頜骨的最大載荷明顯下降(P<0.05)；EV組與OVX組比較，可顯著提高去卵巢大鼠下頜骨最大載荷(P<0.05)，與Sham組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；GB-L組的下頜骨最大載荷較OVX組有所提高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GB-H組可明顯提高去卵巢大鼠下頜骨的載荷水平(P<0.05)。實驗結(jié)果提示高劑量的骨碎補總黃酮可改善下頜骨的最大載荷水平。

組別樣本量最大載荷Sham8163.77±15.82# OVX893.87±18.65? EV8153.89±19.23# GB-L8119.83±15.67? GB-H8132.98±16.73?#

注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05

3 討論

1960年Groen[9]首次報道，頜骨骨丟失與骨質(zhì)疏松癥有相關(guān)性。近年來，不少學者對全身性骨質(zhì)疏松與頜骨骨質(zhì)疏松等口腔骨丟失間的關(guān)系做了若干研究，大多研究結(jié)果證實頜骨骨丟失是全身骨質(zhì)變化的局部表現(xiàn)[10]。Sindeaux等[11]研究證實，全身性骨質(zhì)疏松患者口腔骨密度下降概率顯著增加，López等[12]研究表明，骨質(zhì)疏松女性患者同正常女性一樣，下頜骨骨密度和軀干骨密度呈高度一致性。Jonasson[13]通過5年追蹤研究證實，下頜骨骨量喪失與骨密度顯著相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松女性患者的全身骨量、下頜骨骨量和下頜余牙數(shù)目有顯著相關(guān)性，骨質(zhì)疏松患者的牙齒缺失率明顯高于正常組[14]。在諸多骨質(zhì)疏松動物模型中，切除成年雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法被廣大研究者認識和接受[15]，也逐漸用于頜骨骨丟失的研究中。研究證實，去勢大鼠雌激素水平下降可致使下頜骨骨礦密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞[16]，因此，將去卵巢模型用于誘發(fā)下頜骨骨丟失是一個可靠模型[17]。在本實驗中，Micro-CT結(jié)果顯示OVX組大鼠下頜骨密度較Sham組顯著下降(P<0.05)，骨體積分數(shù)明顯降低(P<0.05)，反映了去卵巢大鼠下頜骨骨組織體積含量明顯下降，下頜骨松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)呈疏松化改變。此外，OVX組的骨小梁數(shù)目、厚度以及骨表面積體積比較Sham組明顯降低(P<0.05)，而骨小梁間隙明顯升高(P<0.05)，說明模型大鼠下頜骨骨小梁大量丟失、間隙增寬、骨結(jié)構(gòu)退變，再次說明去卵巢大鼠下頜骨出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松樣癥狀。同時，OVX組大鼠的下頜骨最大載荷較Sham組明顯減小(P<0.05)，提示伴隨著下頜骨骨量減小、骨微結(jié)構(gòu)改變，去卵巢大鼠的下頜骨抗外力沖擊能力也顯著下降。故在本實驗條件下，用去卵巢手術(shù)制成大鼠下頜骨骨質(zhì)疏松的動物模型是成功的。

本次實驗結(jié)果顯示，與OVX組相比，戊酸雌二醇組的下頜骨骨密度顯著增加(P<0.05)，骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目及厚度也明顯增加(P<0.05)，骨小梁間隙顯著減小(P<0.05),戊酸雌二醇對去卵巢大鼠下頜骨骨質(zhì)疏松模型有良好的修復作用，可以明顯改善下頜骨微結(jié)構(gòu)，增加下頜骨骨量；力學實驗證實戊酸雌二醇對下頜骨骨質(zhì)疏松大鼠的力學性能也有明顯的修復作用。目前，雌激素替代療法對下頜骨骨質(zhì)疏松的治療已進入臨床研究當中，并已取得一定成果[18]。但大量研究證實，雌激素替代療法雖可降低骨轉(zhuǎn)換、保持骨量，但該治療方案會顯著增加子宮內(nèi)膜增生和乳房痛的患病風險[19,20]，甚至導致乳房癌[21]和子宮內(nèi)膜癌。

骨碎補總黃酮是骨碎補中所含黃酮類化合物的總和，性苦、溫，入肝、腎經(jīng)。具有補腎壯骨、續(xù)傷止痛的功效。體外實驗證實，骨碎補總黃酮能促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[22]，并能提高成骨細胞的活性和增殖速度，增加骨形成[23]；動物實驗研究顯示，骨碎補總黃酮能改善股骨超微結(jié)構(gòu)[24]，提高去勢大鼠脛骨骨密度，提高骨質(zhì)量[25]；臨床研究進一步證實骨碎補總黃酮可減輕骨質(zhì)疏松患者的骨痛癥，升高股骨、腰椎的骨密度[26]。由于口腔骨丟失是全身骨質(zhì)變化的局部表現(xiàn)，因此，應用骨碎補總黃酮對頜骨骨丟失進行防治研究具有合理性。

本研究顯示，骨碎補總黃酮連續(xù)治療12 w后，各治療組下頜骨骨密度均有提高，其中骨碎補總黃酮低劑量組與OVX組相比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，骨碎補總黃酮高劑量組較OVX組下頜骨骨密度顯著增加(P<0.05)，但未修復至正常水平，與Sham組相比仍有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。三維重建結(jié)果顯示，骨碎補總黃酮低劑量組的下頜骨相對骨體積、骨小梁數(shù)目較OVX組顯著上升，骨小梁間隙較OVX組顯著下降，各項指標與Sham組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；骨碎補總黃酮高劑量組的治療效果優(yōu)于低劑量組，骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目較OVX組顯著上升(P<0.05)，骨表面積體積比、骨小梁間隙較OVX組顯著下降(P<0.05)，其中骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目與Sham相比已無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。最大載荷測量結(jié)果顯示，各治療組均能提高下頜骨最大載荷，低劑量組與OVX組相比尚無統(tǒng)計學差異，高劑量組雖未恢復至正常水平，但最大載荷較OVX組顯著增加(P<0.05)。以上結(jié)果說明骨碎補總黃酮能增加去卵巢大鼠下頜骨骨量且連續(xù)性較好，改善下頜骨微結(jié)構(gòu)，恢復下頜骨最大載荷，對下頜骨骨量丟失有一定保護作用。而本實驗中是否高劑量骨碎補總黃酮仍未達到最佳治療效果，可在后期進一步研究探索。

綜上所述，去卵巢可誘導大鼠下頜骨骨丟失，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松樣改變。骨碎補總黃酮可以提高去卵巢大鼠下頜骨骨密度及最大載荷，改善下頜骨微結(jié)構(gòu)，高劑量組優(yōu)于低劑量組。但此防治作用的具體機制、最佳劑量等有待進一步研究和探討。