曾輝 趙許兵 徐紅艷 左艷萍 周芳
1. 西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系,陜西 西安 710021 2. 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院急特診科,陜西 西安 710004 3. 陜西省人民醫(yī)院,陜西 西安 710068
骨質(zhì)疏松是影響超過20%50歲以上女性的一種普遍病理狀況[1]。骨質(zhì)疏松癥的主要特征包括骨礦密度降低、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞,以致骨的脆性增加,骨折危險(xiǎn)性增高[2]。研究顯示,絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥可明顯累及下頜骨,頜骨骨質(zhì)喪失是骨質(zhì)疏松在口腔頜面部的局部表現(xiàn)[3]。頜骨骨質(zhì)疏松可加重牙周炎骨吸收,使牙齒缺失率增加[4],同時(shí),頜骨密度降低也影響牙種植體早期骨整合[5],是影響牙種植體成功的危險(xiǎn)因素之一。目前,對(duì)全身骨質(zhì)疏松有改善作用的藥物對(duì)頜骨結(jié)構(gòu)、骨量等的作用如何,已成為研究熱點(diǎn)[6]。骨碎補(bǔ)總黃酮是從中藥骨碎補(bǔ)中提取出來的最主要的一種黃酮成分。研究表明,骨碎補(bǔ)總黃酮可增加骨質(zhì)疏松大鼠股骨和腰椎的骨密度,改善骨顯微結(jié)構(gòu)[7],并已初步運(yùn)用于臨床骨質(zhì)疏松癥的輔助治療[8]。本項(xiàng)研究擬將骨碎補(bǔ)總黃酮以全身用藥的方式給予去勢雌性大鼠,從下頜骨骨量(骨密度)、下頜骨微結(jié)構(gòu)和最大載荷三個(gè)方面探討骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)頜骨骨質(zhì)疏松的改善作用,以期為骨碎補(bǔ)總黃酮防治頜骨骨丟失的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
40只3月齡雌性未孕SD大鼠(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重(230±30)g。自由飲水,分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,按體重對(duì)等原則隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(Sham)、去卵巢模型組(OVX)、戊酸雌二醇組(EV)、骨碎補(bǔ)總黃酮低劑量組(GB-L)和骨碎補(bǔ)總黃酮高劑量組(GB-H),每組8只,實(shí)驗(yàn)過程中無動(dòng)物死亡。
骨碎補(bǔ)總黃酮(中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院和四川中藥研究所研制,批號(hào)961214),使用時(shí)加滅菌水制成一定濃度溶液(0.46 g/L)灌胃治療。戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號(hào)20130009)。水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。顯微CT儀(Inveon, Siemens, Germany),日本島津自動(dòng)控制萬能試驗(yàn)機(jī)(AG-IC型號(hào)),超純水儀(Milipore,F(xiàn)rance)。
Sham組僅切除雙側(cè)卵巢附近脂肪組織,其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。10%水合氯醛按0.38 mL/100 g體重,腹腔注射,對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上,在背部1/3處剪毛,用碘酊、酒精局部消毒皮膚,取腰椎后側(cè)正中切口,鈍性分離肌肉組織,可見位于兩側(cè)腎臟外下方呈淡粉紅色的卵巢及子宮,在子宮角上作兩個(gè)結(jié)扎后切斷子宮角,將卵巢完整摘除后撒上青霉素粉,縫合皮膚,消毒傷口。術(shù)后一周對(duì)建模大鼠進(jìn)行陰道涂片,連續(xù)5 d,觀察去卵巢大鼠不出現(xiàn)動(dòng)情周期,表明去除卵巢成功。術(shù)后3個(gè)月,各組大鼠進(jìn)行灌胃治療。
GB-H組灌胃給予骨碎補(bǔ)總黃酮216 mg/(kg·d),GB-L組灌胃給予骨碎補(bǔ)總黃酮108 mg/(kg·d),EV組灌胃給予戊酸雌二醇0.1 mg/(kg·d),Sham組和OVX組給予等計(jì)量的生理鹽水,連續(xù)服藥12 w。
各組大鼠灌胃治療12 w后過量麻醉處死,取大鼠左側(cè)下頜骨并剝離附著在上面的軟組織,凍存于-80 ℃冰箱中備用,測量前于室溫下解凍。將大鼠下頜骨置于Micro-CT掃描球管中進(jìn)行正位掃描,采用手動(dòng)分析模式測定下頜骨骨密度。骨密度以骨量/骨投影面積(g/cm2)表示。
將處理好的下頜骨標(biāo)本沿長軸垂直固定于樣品固定器內(nèi),選擇掃描參數(shù):掃描方式360°旋轉(zhuǎn),電壓80kV,電流80μA。圖像矩陣為1024×1024,曝光時(shí)間2 960 ms。掃描完成后,如圖1所示,選取第二磨牙近中根的近中至第三磨牙遠(yuǎn)中根的遠(yuǎn)中根尖1/3區(qū)的骨組織為感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)行三維重組。獲得重組圖像后,使用Mirco-CT自帶軟件進(jìn)行定量分析。各測量分析參數(shù)及意義見表1。
各組大鼠灌胃治療12 w后過量麻醉處死,將右側(cè)下頜骨關(guān)節(jié)端及切牙端包埋于樹脂當(dāng)中,下頜磨牙區(qū)暴露,樹脂塊底部與地平面平行,置于日本島津自動(dòng)控制萬能試驗(yàn)機(jī)測試,加載點(diǎn)為下頜第二磨牙處,跨距為20 mm,加載速度為0.5 N/min,逐漸加力,直至骨完全斷裂,實(shí)驗(yàn)中用生理鹽水噴灑下頜骨表面,保持濕潤。
注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05
各組大鼠下頜骨骨密度測量結(jié)果見表2。由表2可以看出,OVX組與Sham組相比,下頜骨密度顯著降低(P<0.05)。EV組干預(yù)治療12 w后,已有明顯的修復(fù)作用,與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);GB-H組干預(yù)治療12 w后,下頜骨骨密度雖未恢復(fù)至正常水平,但骨密度已比OVX組顯著提高(P<0.05);GH-L組下頜骨骨密度雖有一定程度增加,但與OVX組相比尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
組別樣本量骨密度Sham81.118±0.006# OVX80.797±0.041? EV81.108±0.013# GB-L80.909±0.027? GB-H81.013±0.033?#
注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05
圖1 各組大鼠下頜骨顯微結(jié)構(gòu)圖,紅色區(qū)域?yàn)轱@微CT目標(biāo)分析區(qū)域A:假手術(shù)組;B:去卵巢模型組;C:戊酸雌二醇組;D:骨碎補(bǔ)總黃酮低劑量組;E:骨碎補(bǔ)總黃酮高劑量組Fig.1 Micrographs of the vertical section of mandible in rats of different groups. The red area is the micro-CT target analysis area. A: Sham group; B: OVX group; C: EV group; D: GB-L group; E: GB-H group.
各組大鼠下頜骨骨組織的感興趣區(qū)行三維重組后得出三維測量結(jié)果(表3,圖1)。由表3可知,OVX組與Sham組相比,下頜骨BV/TV下降56.6%,Tb.Th、Tb.N顯著降低(P<0.05),BS/BV、Tb.Sp則明顯增加(P<0.05),骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與OVX組比較,EV組大鼠下頜骨BV/TV顯著上升(P<0.05),Tb.Th、Tb.N顯著增加(P<0.05),BS/BV、Tb.Sp顯著減小(P<0.05),骨微結(jié)構(gòu)得到良好修復(fù),已與Sham組無明顯差異(P>0.05)。與OVX比較,GB-H組的BV/TV上升41.6%,Tb.N增加42.2%,BS/BV、Tb.Sp顯著減小(P<0.05),Tb.Th尚未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以上結(jié)果顯示高劑量的骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)下頜骨微結(jié)構(gòu)有一定程度的改善作用。與OVX組比較,GB-L組BV/TV上升20%,Tb.N增加24%,Tb.Sp顯著減小(P<0.05), Tb.Th、BS/BV無明顯改變(P>0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低劑量的骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)去卵巢大鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)有一定改善趨勢,但效果不及高劑量組。
如表4所示,與Sham組比較,OVX組大鼠下頜骨的最大載荷明顯下降(P<0.05);EV組與OVX組比較,可顯著提高去卵巢大鼠下頜骨最大載荷(P<0.05),與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);GB-L組的下頜骨最大載荷較OVX組有所提高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);GB-H組可明顯提高去卵巢大鼠下頜骨的載荷水平(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示高劑量的骨碎補(bǔ)總黃酮可改善下頜骨的最大載荷水平。
組別樣本量最大載荷Sham8163.77±15.82# OVX893.87±18.65? EV8153.89±19.23# GB-L8119.83±15.67? GB-H8132.98±16.73?#
注: VS Sham,*P<0.05; VS OVX,#P<0.05
1960年Groen[9]首次報(bào)道,頜骨骨丟失與骨質(zhì)疏松癥有相關(guān)性。近年來,不少學(xué)者對(duì)全身性骨質(zhì)疏松與頜骨骨質(zhì)疏松等口腔骨丟失間的關(guān)系做了若干研究,大多研究結(jié)果證實(shí)頜骨骨丟失是全身骨質(zhì)變化的局部表現(xiàn)[10]。Sindeaux等[11]研究證實(shí),全身性骨質(zhì)疏松患者口腔骨密度下降概率顯著增加,López等[12]研究表明,骨質(zhì)疏松女性患者同正常女性一樣,下頜骨骨密度和軀干骨密度呈高度一致性。Jonasson[13]通過5年追蹤研究證實(shí),下頜骨骨量喪失與骨密度顯著相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松女性患者的全身骨量、下頜骨骨量和下頜余牙數(shù)目有顯著相關(guān)性,骨質(zhì)疏松患者的牙齒缺失率明顯高于正常組[14]。在諸多骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中,切除成年雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法被廣大研究者認(rèn)識(shí)和接受[15],也逐漸用于頜骨骨丟失的研究中。研究證實(shí),去勢大鼠雌激素水平下降可致使下頜骨骨礦密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞[16],因此,將去卵巢模型用于誘發(fā)下頜骨骨丟失是一個(gè)可靠模型[17]。在本實(shí)驗(yàn)中,Micro-CT結(jié)果顯示OVX組大鼠下頜骨密度較Sham組顯著下降(P<0.05),骨體積分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05),反映了去卵巢大鼠下頜骨骨組織體積含量明顯下降,下頜骨松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)呈疏松化改變。此外,OVX組的骨小梁數(shù)目、厚度以及骨表面積體積比較Sham組明顯降低(P<0.05),而骨小梁間隙明顯升高(P<0.05),說明模型大鼠下頜骨骨小梁大量丟失、間隙增寬、骨結(jié)構(gòu)退變,再次說明去卵巢大鼠下頜骨出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松樣癥狀。同時(shí),OVX組大鼠的下頜骨最大載荷較Sham組明顯減小(P<0.05),提示伴隨著下頜骨骨量減小、骨微結(jié)構(gòu)改變,去卵巢大鼠的下頜骨抗外力沖擊能力也顯著下降。故在本實(shí)驗(yàn)條件下,用去卵巢手術(shù)制成大鼠下頜骨骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型是成功的。
本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與OVX組相比,戊酸雌二醇組的下頜骨骨密度顯著增加(P<0.05),骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目及厚度也明顯增加(P<0.05),骨小梁間隙顯著減小(P<0.05),戊酸雌二醇對(duì)去卵巢大鼠下頜骨骨質(zhì)疏松模型有良好的修復(fù)作用,可以明顯改善下頜骨微結(jié)構(gòu),增加下頜骨骨量;力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)戊酸雌二醇對(duì)下頜骨骨質(zhì)疏松大鼠的力學(xué)性能也有明顯的修復(fù)作用。目前,雌激素替代療法對(duì)下頜骨骨質(zhì)疏松的治療已進(jìn)入臨床研究當(dāng)中,并已取得一定成果[18]。但大量研究證實(shí),雌激素替代療法雖可降低骨轉(zhuǎn)換、保持骨量,但該治療方案會(huì)顯著增加子宮內(nèi)膜增生和乳房痛的患病風(fēng)險(xiǎn)[19,20],甚至導(dǎo)致乳房癌[21]和子宮內(nèi)膜癌。
骨碎補(bǔ)總黃酮是骨碎補(bǔ)中所含黃酮類化合物的總和,性苦、溫,入肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)腎壯骨、續(xù)傷止痛的功效。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),骨碎補(bǔ)總黃酮能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[22],并能提高成骨細(xì)胞的活性和增殖速度,增加骨形成[23];動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,骨碎補(bǔ)總黃酮能改善股骨超微結(jié)構(gòu)[24],提高去勢大鼠脛骨骨密度,提高骨質(zhì)量[25];臨床研究進(jìn)一步證實(shí)骨碎補(bǔ)總黃酮可減輕骨質(zhì)疏松患者的骨痛癥,升高股骨、腰椎的骨密度[26]。由于口腔骨丟失是全身骨質(zhì)變化的局部表現(xiàn),因此,應(yīng)用骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)頜骨骨丟失進(jìn)行防治研究具有合理性。
本研究顯示,骨碎補(bǔ)總黃酮連續(xù)治療12 w后,各治療組下頜骨骨密度均有提高,其中骨碎補(bǔ)總黃酮低劑量組與OVX組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),骨碎補(bǔ)總黃酮高劑量組較OVX組下頜骨骨密度顯著增加(P<0.05),但未修復(fù)至正常水平,與Sham組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。三維重建結(jié)果顯示,骨碎補(bǔ)總黃酮低劑量組的下頜骨相對(duì)骨體積、骨小梁數(shù)目較OVX組顯著上升,骨小梁間隙較OVX組顯著下降,各項(xiàng)指標(biāo)與Sham組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);骨碎補(bǔ)總黃酮高劑量組的治療效果優(yōu)于低劑量組,骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目較OVX組顯著上升(P<0.05),骨表面積體積比、骨小梁間隙較OVX組顯著下降(P<0.05),其中骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目與Sham相比已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。最大載荷測量結(jié)果顯示,各治療組均能提高下頜骨最大載荷,低劑量組與OVX組相比尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,高劑量組雖未恢復(fù)至正常水平,但最大載荷較OVX組顯著增加(P<0.05)。以上結(jié)果說明骨碎補(bǔ)總黃酮能增加去卵巢大鼠下頜骨骨量且連續(xù)性較好,改善下頜骨微結(jié)構(gòu),恢復(fù)下頜骨最大載荷,對(duì)下頜骨骨量丟失有一定保護(hù)作用。而本實(shí)驗(yàn)中是否高劑量骨碎補(bǔ)總黃酮仍未達(dá)到最佳治療效果,可在后期進(jìn)一步研究探索。
綜上所述,去卵巢可誘導(dǎo)大鼠下頜骨骨丟失,出現(xiàn)骨質(zhì)疏松樣改變。骨碎補(bǔ)總黃酮可以提高去卵巢大鼠下頜骨骨密度及最大載荷,改善下頜骨微結(jié)構(gòu),高劑量組優(yōu)于低劑量組。但此防治作用的具體機(jī)制、最佳劑量等有待進(jìn)一步研究和探討。