神經(jīng)肽在去卵巢大鼠骨組織中表達(dá)差異的實(shí)驗(yàn)研究

王雙磊 韓燚 謝瑋鑫 李展春* 肖潔

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科, 上海 200127 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院麻醉科, 上海 200127

骨質(zhì)疏松是威脅絕經(jīng)后老年女性人群健康的常見(jiàn)病之一。 絕經(jīng)后的女性, 表現(xiàn)為雌激素下降, 骨代謝加快, 同時(shí)伴隨骨量丟失和骨強(qiáng)度降低, 機(jī)體往往經(jīng)受輕微的創(chuàng)傷就容易發(fā)生骨折, 因此防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松對(duì)促進(jìn)老年女性健康以及提高其生活質(zhì)量有著重要意義。P物質(zhì)(substance P, SP), 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP), 血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)由背根神經(jīng)節(jié)或交感/副交感神經(jīng)節(jié)合成, 運(yùn)輸?shù)焦呛凸悄ど系呢S富的交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)末梢, 以密集囊泡的方式儲(chǔ)存以及釋放。SP, CGRP, VIP和NPY與骨組織中的成骨細(xì)胞, 破骨細(xì)胞, 骨細(xì)胞, 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)上的神經(jīng)肽受體結(jié)合, 對(duì)骨組織的生長(zhǎng), 代謝和骨重建發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)SP, CGRP, VIP和NPY在去卵巢大鼠和假手術(shù)大鼠脛骨干骺端的表達(dá)及其與骨密度(bone mineral density, BMD)之間的關(guān)系, 探討神經(jīng)肽在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)(SPF)6月齡雌性未孕Sprague-Dawley大鼠12只, 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備：電子天平；烘箱(上海博訊)；高壓滅菌器(SANYA公司)；美國(guó)LUNAR 雙能X線骨密度儀(DXA)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)材料：多聚甲醛(碧云天公司)；戊巴比妥鈉(碧云天公司)；0.9%氯化鈉溶液(上海百特醫(yī)療用品有限公司)；青霉素；四肽(抗-SP抗體, 1∶1000, Abcam, Cambridge, USA；抗-CGRP抗體, 1∶400, Abcam, Cambridge, USA；抗-VIP抗體, 1:20, Abcam, Cambridge, USA；抗-NPY抗體, 1∶1000, Abcam, Cambridge, USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備：清潔級(jí)(SPF)6月齡雌性未孕SD大鼠12只, 體重290～310 g, 隨機(jī)分為兩組(n=12)：去卵巢組(OVX)和假手術(shù)組(Sham)。兩組大鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg), 去卵巢組大鼠經(jīng)腰背部雙側(cè)切口進(jìn)入腹腔, 切除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組：在卵巢附近切除和卵巢重量相等的脂肪。去卵巢組和假手術(shù)組大鼠均分開(kāi)飼養(yǎng)在相同鼠籠, 每日攝食量相當(dāng), 飲水不限。術(shù)后均予青霉素10萬(wàn)U腹腔注射3 d預(yù)防感染。

1.2.2骨密度檢測(cè)：兩組動(dòng)物術(shù)后均飼養(yǎng)12 w, 3%戊巴比妥麻醉后, 四肢展開(kāi)平臥于雙能X線骨密度儀平臺(tái)上檢測(cè)骨密度。

1.2.3標(biāo)本的制備：兩組動(dòng)物術(shù)后均飼養(yǎng)12 w, 應(yīng)用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后, 稱(chēng)重后脫臼法處死大鼠, 取子宮稱(chēng)重(濕重)。收集右側(cè)脛骨干骺端, 剔除軟組織后立即投入到4%多聚甲醛中, 室溫固定，EDTA脫鈣, 酒精梯度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋。沿著縱軸切5 μm厚的切片，依次脫蠟，水化后，用煮沸的枸櫞酸進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS(0.01 mol/L,pH7.4)沖洗15 min, 含有3%H2O2的甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10 min, 滴加正常的山羊血清封閉液，分別滴加Ⅰ抗4℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，滴加S-P孵育15 min，DAB顯色，Mayer's蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，封片。

1.2.4觀察和顯微攝影：在光學(xué)顯微鏡下選取陽(yáng)性結(jié)果區(qū)進(jìn)行拍照(E800, Nikon, Tokyo, Japan)SP, CGRP,VIP和NPY免疫陽(yáng)性表現(xiàn)為棕色斑片狀或束狀。用Spot Advanced digital-imaging 系統(tǒng)(Diagnostic Instruments, Inc, Sterling Heights, MI, USA)在放大400倍的顯微鏡下選擇3個(gè)視野區(qū)進(jìn)行觀察。用Pro Plus(version 5.0.1, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)軟件, 以MOD作為量化指標(biāo), 對(duì)免疫組化陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重, 子宮濕重和BMD

造模后12 w, OVX組大鼠體重增加, 與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；OVX組大鼠子宮濕重, BMD降低, 與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠脛骨干骺端神經(jīng)肽MOD值

造模后12 w, OVX組大鼠SP、CGRP和VIP的MOD值降低, 與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；OVX組大鼠NPY的MOD值升高, 與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 造模后12 w, OVX組和Sham組大鼠體重, 子宮濕重和BMD值比較Table 1 Comparison of body weight, uterus weight and BMD of rats from Sham and OVX group

注：與Sham組相比較，*P<0.01

圖1 大鼠脛骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值與BMD之間的相關(guān)關(guān)系Fig.1 Relationship between BMD and the MOD of SP, CGRP, VIP and NPY of rats’ tibia metaphysis

表2 造模后12 w, OVX組和Sham組大鼠SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值比較Table 2 Comparison of MOD of SP, CGRP, VIP and NPY of rats from Sham and OVX group

注：與Sham組相比較，*P<0.01

2.3 大鼠脛骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值與BMD值之間的關(guān)系。

造模后12 w, 大鼠SP, VIP的MOD值與BMD值成正相關(guān)關(guān)系(r=0.746,P=0.005；r=0.591,P=0.043), 大鼠NPY的MOD值與BMD值成負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.666,P=0.018)。見(jiàn)圖1。

3 討論

本研究探討了OVX組大鼠與Sham組大鼠脛骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的表達(dá)。首先通過(guò)雙側(cè)去卵巢法建立雌激素缺乏的大鼠骨質(zhì)疏松模型[4]。本研究中, 造模后12 w, OVX組大鼠BMD值(0.230±0.013) g/cm2低于Sham組大鼠BMD值(0.261±0.019) g/cm2, OVX組大鼠體重(450.49±44.42) g大于Sham組大鼠體重(334.39±44.18) g, OVX組大鼠子宮濕重(0.22±0.08) g低于Sham組大鼠子宮濕重(0.67±0.08) g, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果與其他類(lèi)似的研究結(jié)果相同, 雙側(cè)卵巢切除術(shù)后大鼠體重增加, 子宮萎縮, BMD下降[5,6]。研究結(jié)果表明, 雙側(cè)卵巢切除術(shù)后12 w, 大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。

本研究表明, 與Sham組相比較, OVX組大鼠SP的MOD值降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。楊鋒等[7]研究表明，SP在骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中的表達(dá)降低。鄭新峰等[5]研究表明, 雙側(cè)卵巢切除術(shù)后3 w和6 w, 小鼠骨組織SP表達(dá)下降。Ding等[2]研究SP含量在OVX小鼠骨折愈合過(guò)程中的變化時(shí)發(fā)現(xiàn), OVX組小鼠骨折部位SP含量低于對(duì)照組。兩組大鼠SP的MOD值與BMD值成正相關(guān)關(guān)系(r=0.746,P=0.005)。SP通過(guò)與細(xì)胞上的受體結(jié)合發(fā)揮生理病理作用，其中SP與神經(jīng)激肽-1(neurokinin-1，NK-1)受體的結(jié)合力最大。NK-1受體在大鼠的BMSCs，成骨細(xì)胞，骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages, BMMS)，破骨細(xì)胞上都有表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SP能增加大鼠顱骨成骨細(xì)胞礦化小結(jié)的形成，SP的這種成骨作用能被NK-1受體拮抗劑所抑制[8]。高濃度的SP能刺激BMSCs的增殖和礦化，低濃度的SP能增加晚期BMSCs的成骨分化。正常大鼠松質(zhì)骨中的SP濃度表現(xiàn)為低濃度， 本研究中OVX組比Sham組大鼠脛骨干骺端SP表達(dá)降低，SP對(duì)大鼠骨組織中BMSCs, 成骨細(xì)胞的成骨刺激作用減弱，導(dǎo)致成骨活性下降，骨密度降低，SP可能參與了骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[9]。

本研究結(jié)果顯示, 與Sham組比較, OVX組大鼠CGRP的MOD值降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CGRP通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活因子-4(activating transcription factor-4,ATF4)和骨鈣素(osteocalcin, OC)的表達(dá)，刺激成骨細(xì)胞的分化；CGRP也能通過(guò)影響骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的比值，抑制破骨細(xì)胞的生成[10]。BMSCs，成骨細(xì)胞，BMMS和破骨細(xì)胞都有CGRP受體的表達(dá)。CGRP(10-10-10-8mol/L)能刺激BMSCs增殖，上調(diào)成骨基因的表達(dá)，增加BMSCs堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和礦化程度。CGRP(10-8mol/L)能抑制BMM中NF-κB對(duì)RANKL的激活, 下調(diào)破骨基因，抑制BMMS的骨吸收活性[11,12]。這些研究表明，CGRP在體內(nèi)生理濃度下具有促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收的作用。

NPY是神經(jīng)系統(tǒng)合成和分泌的一種生物活性物質(zhì), 在骨組織中NPY通過(guò)與其特異性Y受體結(jié)合, 調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性, 從而在骨的生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。骨組織中成骨細(xì)胞系細(xì)胞上有NPY Y1受體的表達(dá)，NPY Y2受體在骨組織中不表達(dá)。NPY能抑制BMSCs到成骨細(xì)胞系的分化，降低大鼠顱骨成骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)和礦物質(zhì)的沉積[13]。本研究結(jié)果顯示, 與Sham組比較, OVX組大鼠NPY的MOD值升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大鼠NPY的MOD值與BMD值成負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.666,P=0.018)。Xiao等[3]在研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者和骨性關(guān)節(jié)炎患者的股骨頭松質(zhì)骨神經(jīng)肽表達(dá)和骨微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎患者, 骨質(zhì)疏松患者的股骨頭松質(zhì)骨SP, CGRP和VIP表達(dá)降低, NPY表達(dá)增高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于Sham組大鼠, OVX組大鼠表現(xiàn)為SP, CGRP和VIP表達(dá)降低, NPY表達(dá)增高, 與上述研究結(jié)果相符。

神經(jīng)纖維大多分布于骨組織中代謝活躍的部位。VIP是交感神經(jīng)分泌的一種神經(jīng)肽, VIP在骨膜、骨髓腔、血管中都有表達(dá)；VIP受體在骨膜、骨髓腔、 血管、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞中有表達(dá)[14,15]。本研究結(jié)果顯示, 與Sham組比較, OVX組大鼠VIP的MOD值降低(P<0.01), 大鼠VIP的MOD值與BMD值成正相關(guān)關(guān)系(r=0.592,P=0.043)。大鼠成骨細(xì)胞表面有VIP type 2受體(VPAC2受體), VIP與VPAC2受體結(jié)合, 影響成骨細(xì)胞RANKL和OPG表達(dá)。VIP能通過(guò)降低RANKL/OPG的比值抑制破骨細(xì)胞的分化, 降低破骨細(xì)胞活性和骨吸收功能[14]。

本研究結(jié)果中, SP, CGRP和VIP在去卵巢組大鼠骨組織中表達(dá)降低, NPY在去卵巢組大鼠骨組織中表達(dá)升高, SP, VIP和NPY表達(dá)與MOD值之間有相關(guān)性, 由此推斷神經(jīng)肽可能參與了去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制, 影響這些神經(jīng)肽的表達(dá)可能作為抗骨質(zhì)疏松治療的一種方法。但是本研究中只探討了神經(jīng)肽在骨組織中的變化, 且樣本量較低, 需要全面闡述神經(jīng)肽在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中的作用, 進(jìn)一步探討可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制, 為神經(jīng)肽在骨質(zhì)疏松疾病發(fā)生發(fā)展中提供理論基礎(chǔ)。