硫酸乙酰肝素對(duì)乳鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖及分化成熟的影響

劉儀 徐朱杰 王瑞 邱立朋 陳敬華*

1. 江南大學(xué)藥學(xué)院藥用生物高分子研究室, 江蘇 無錫 214122 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院骨科, 江蘇 無錫 214000

硫酸乙酰肝素(heparin sulfate, HS)作為糖胺聚糖家族的一類陰離子多糖成員，是由二糖基單元重復(fù)形成的高硫酸化結(jié)構(gòu)的線型多糖，并以共價(jià)鍵的形式連接于核心蛋白絲氨酸甘氨酸殘基上組成HS蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)[1]。在成骨方面，以往研究發(fā)現(xiàn)，HS長(zhǎng)鏈通過非共價(jià)結(jié)合方式與對(duì)骨形成有重要作用的生長(zhǎng)因子結(jié)合發(fā)揮自身的生物作用[2]。HS長(zhǎng)鏈與很多參與骨折愈合的肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子(heparin-binding growth factors，HSGFs)如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等結(jié)合，從而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子活性，保護(hù)這些生長(zhǎng)因子免受蛋白酶的降解，并依靠維持穩(wěn)定的信號(hào)分子濃度梯度來實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞，影響許多生化過程[3,4]。然而HS對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化成熟的作用，至今仍存在一定的爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為，HS可以通過一些機(jī)制包括影響細(xì)胞粘附作用[5]、細(xì)胞遷移功能[6]和FGFs的細(xì)胞表面受體的功能[7,8]，來產(chǎn)生抗MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用。而另外一些研究則認(rèn)為，HS可以通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導(dǎo)從而促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖[9]。Sabbieti等[10]亦表示前列腺素F2a(prostaglandin F2a, PGF2a)主要依賴于HSPGs來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖。另外，關(guān)于HS體外促進(jìn)成骨細(xì)胞作用的最適濃度研究也尚未有報(bào)道。據(jù)此，我們實(shí)驗(yàn)室通過粗品肝素鈉制備和提純的HS對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化以及基質(zhì)礦化的作用進(jìn)行相關(guān)研究，進(jìn)而找出有利于成骨細(xì)胞活性的最適HS濃度，為HS應(yīng)用于骨缺損愈合及抗骨質(zhì)疏松的治療提供理論基礎(chǔ)，并為骨組織工程技術(shù)提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

出生24 h內(nèi)的新生SD大鼠8只，不計(jì)體重、不分雌雄，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2011-0003，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；粗品肝素鈉(山東辰中生物有限公司)；AKP染色試劑盒-鈣鈷法(南京建成生物工程研究所)；堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；MTT試劑盒(Sigma公司，美國(guó))；兔多克隆抗體RUNX2(Abcam公司，英國(guó))；兔多克隆抗體Collagen I(Abcam公司，英國(guó))；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(Abcam公司，英國(guó))；兔多克隆抗體β-Actin(Abcam公司，英國(guó))；茜素紅s染液(北京Solarbio科技有限公司)；Giemsa染液(北京Solarbio科技有限公司)；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；SDS-PAGE凝膠電泳裝置(Bio-Rad公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司，美國(guó))。

1.2 硫酸乙酰肝素的制備及純化

以粗品肝素(crud heparin,CHP)為原料，通過本實(shí)驗(yàn)室既往實(shí)驗(yàn)方法制備和提純HS。該方法總共分為三個(gè)階段：預(yù)處理階段、提取分離階段和純化階段。在預(yù)處理階段，主要采用通過酶解脫蛋白，低濃度雙氧水除去色素，乙醇沉淀的方法去除 CHP 中的雜質(zhì)。提取分離階段采用陰離子交換得到硫酸乙酰肝素。純化階段則是聯(lián)合乙醇分級(jí)沉淀方法和超濾的手段，通過 GPC 圖譜，觀測(cè)到HS 重均分子量為 10.81k Da，分散度為 1.106， 證明成功制備了高純度HS，見圖1。

圖1 a. 乙醇分級(jí)沉淀瓊脂糖凝膠電泳圖譜 b. HS 的 GPC 光散射聯(lián)用色譜圖Fig.1 a. Agarose-gel electrophoretic of polysaccharides purification by sequential precipitation with ethanol b. The chromatograph of high purity HS molecular weight by SEC-MALLS

1.3 成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

1.3.1成骨細(xì)胞分離：取出生24 h內(nèi)的SD大鼠8只，斷頸處死后投入裝有75%乙醇的燒杯內(nèi)消毒10 min，無菌手術(shù)取出小鼠的顱蓋骨，去除骨膜及周圍組織，用含1%青-鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗至顱骨白色，再將顱骨剪成0.5 mm×0.5 mm的小骨片。加入0.25%的胰蛋白酶/EDTA溶液處理骨片，200 r/min，37 ℃恒溫空氣搖床上消化25 min，1 500 r/min離心10 min，去上清酶。用PBS 洗滌后加入0.1% Ⅱ型膠原酶溶液5 mL，200 r/min，37 ℃恒溫空氣搖床上消化120 min。用 100 目篩網(wǎng)過濾消化液后收集上清液，室溫下1 000 r/min離心5 min，小心棄上清，保留沉淀。用 PBS 洗滌沉淀 2 次，加入2 mL含 10% FBS的培養(yǎng)基，小心吹勻，觀察此時(shí)的細(xì)胞密度，以1.0×104的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，加入2 mL含10% FBS的培養(yǎng)基，并利用反復(fù)貼壁法初步純化細(xì)胞。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h于倒置相差顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞貼壁情況，直至成骨細(xì)胞完全貼壁。24 h后首次更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞及殘留的組織塊，以后每3天更換培養(yǎng)基一次，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況并拍照。

1.3.2Giemsa染液染色：取生長(zhǎng)情況良好的第二代成骨細(xì)胞，小心吸除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS漂洗貼壁細(xì)胞3次，2 mL甲醇浸泡固定細(xì)胞10 min，將培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞干燥后直接染色，按1 mL/cm2的比例滴加吉姆薩染液，覆滿皿底細(xì)胞層，染色2 min后，移除染液，用去離子水沖洗3次，濕板在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3AKP染色(鈣鈷法)：取生長(zhǎng)情況良好的第三代成骨細(xì)胞，小心吸除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS漂洗貼壁細(xì)胞3次，95%的乙醇固定10 min，去除乙醇，干燥培養(yǎng)皿后，按AKP試劑盒的要求進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4茜素紅染液染色：取生長(zhǎng)情況良好的第三代成骨細(xì)胞，小心吸除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS漂洗貼壁細(xì)胞3次，用95%乙醇固定10 min，去除乙醇，干燥培養(yǎng)皿后，按1 mL/cm2的比例滴加茜素紅染液，鋪滿皿底，在顯微鏡下觀察，見鈣鹽染色較深立即移除染液，去離子水小心沖洗3次，濕板鏡下觀察并拍照。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組：依據(jù)在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度HS，將實(shí)驗(yàn)分為A組(0 μg/mL)、B組(1μg/mL)、C組(5μg/mL)、D組(10μg/mL)、E組(25μg/mL)、F組(50μg/mL)、G組(100μg/mL)。以A為對(duì)照組，其余組為實(shí)驗(yàn)組。

1.4.2細(xì)胞增殖情況檢測(cè)：取二代成骨細(xì)胞以2.0×104濃度接種于96孔板中，每組5孔，每孔100 μL，按分組干預(yù)后于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h和96 h后MTT法分別測(cè)定各孔波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4.3細(xì)胞分化情況檢測(cè)：將二代成骨細(xì)胞以2.0×104濃度接種于48孔板中，待細(xì)胞貼壁后，移除培養(yǎng)基上清，按分組干預(yù)后于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h和48 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL 1%的TritonX-100裂解液，覆滿細(xì)胞層，室溫裂解后從中取出30 μL，按AKP測(cè)定試劑盒的要求進(jìn)行操作，測(cè)定各孔在波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值。同時(shí)，按BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒操作，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.001x + 0.151)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相應(yīng)的蛋白含量(μg)，最后根據(jù)AKP活力公式計(jì)算出AKP活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4.4功能蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western法。將HS濃度分為0 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL三組，各濃度組下的三代成骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h和48 h后，分別行Collagen I和Runx-2蛋白量檢測(cè)。棄去6孔板中的各濃度培養(yǎng)基，以4 ℃預(yù)冷的PBS充分漂洗板底3次，細(xì)胞刮刀直接將成骨細(xì)胞從板底刮下，加入100 μL RIPA裂解液，冰上靜置，充分裂解。將裂解產(chǎn)物反復(fù)凍融，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法進(jìn)行總蛋白定量。取20 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用2%脫脂奶粉室溫?fù)u床振蕩封閉2 h，加入1∶1000的兔抗β-Actin和1∶1000的兔抗Runx-2和兔抗Collagen I，4 ℃過夜。第二天加入1∶10000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后ECL曝光顯色，曝光時(shí)間視實(shí)驗(yàn)效果而定。

圖2 a. 剛接種的原代成骨細(xì)胞(×200)b. 原代成骨細(xì)胞第三天(×200)c. 原代成骨細(xì)胞第九天(×100)d. 第二代成骨細(xì)胞Giemsa染色(×100)e. 第三代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色(×40)f. 第三代成骨細(xì)胞茜素紅s染色(×100)Fig.2 a. Newly inoculated primary osteoblasts(×200)b. Primary osteoblasts at third day(×200)c. Primary osteoblasts at ninth day (×100) d. Giemsa staining of second generation osteoblasts (×100) e. Alkaline phosphatase staining of third generation osteoblasts (×40) f. Alizarin red S staining of third generation osteoblasts (×100)

1.4.5細(xì)胞礦化能力檢測(cè)：取二代成骨細(xì)胞以1.0×104濃度接種于24孔板中，14 d后按茜素紅染色方法染色，于40倍鏡下計(jì)數(shù)各組5個(gè)視野的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞鑒定

2.1.1細(xì)胞形態(tài)觀察：剛分離接種的原代成骨細(xì)胞呈球形，漂浮在培養(yǎng)基中，接種后12 h左右，成骨細(xì)胞完全貼壁，但未完全伸展，貼壁的成骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、圓形、三角形和不規(guī)則多角形。細(xì)胞有兩個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)短不一的突起，單核多位于細(xì)胞中央，核內(nèi)一般有1～5個(gè)較小的核仁。接種后細(xì)胞可逐漸鋪展開，體積明顯增大，突起增多。細(xì)胞6～8 d能鋪滿皿底，相鄰細(xì)胞靠突觸相互聯(lián)結(jié)，最后重疊生長(zhǎng)，呈鋪路石狀。(見圖2 a～2c)。

2.1.2Giemsa染色：成骨細(xì)胞胞漿胞漿豐富，被染成淺藍(lán)色，單個(gè)細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，位于細(xì)胞中央，被染成紫藍(lán)色或深紅色，核內(nèi)有1～5個(gè)核仁。(見圖2 d)。

2.1.3AKP染色：胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黑色顆?；驂K狀、條狀沉淀。(見圖2e)。

2.1.4茜素紅染色：成骨基質(zhì)鈣化產(chǎn)物在一定區(qū)域內(nèi)堆集成灶，與茜素紅染液反應(yīng)可見橙紅色鈣化結(jié)節(jié)。100倍鏡下可見單視野中散在多個(gè)鈣化灶，形狀多不規(guī)則，大小不一，類圓形為主，顏色中間染色較深周圍較淺，兩鈣化灶可以互相融合。(見圖2f)。

2.2 細(xì)胞增殖情況檢測(cè)

MTT檢測(cè)示，在48 h，A，B，C，D，E，F(xiàn)，G組吸光度值(A)分別為0.2345±0.0172，0.1840±0.0156，0.1575±0.0117，0.1678±0.0117，0.1553±0.0132，0.1565±0.0119，0.1520±0.0141。A組的吸光度值(A)顯著高于B、C、D、E、F、G組，而B、C、D、E、F、G組組間的吸光度值(A)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣在96 h，A，B，C，D，E，F(xiàn)，G組吸光度值(A)分別為0.8308±0.0148，0.7238±0.0481，0.6898±0.0570，0.6942±0.0491，0.7174±0.0356，0.6650±0.0591，0.6844±0.0408。A組的吸光度值(A)顯著高于B、C、D、E、F、G組，而B、C、D、E、F、G組組間的吸光度值(A)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見圖3)。

圖3 不同濃度的HS對(duì)成骨細(xì)胞作用48 h、96 h后對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響注：與對(duì)照組比較，*P<0.05Fig.3 Effects of different concentrations of HS on osteoblast proliferation after 48 h and 96 hNote: *P<0.05 VS the control group

2.3 細(xì)胞分化情況檢測(cè)

圖4 不同濃度的HS對(duì)成骨細(xì)胞作用24 h和48 h后對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)AKP活性的影響注：與對(duì)照組比較，*P<0.05Fig.4 Effects of different concentrations of HS on the activity of AKP in osteoblasts after 24 h and 48 hNote: *P<0.05 VS the control group

AKP檢測(cè)示，B、C、D、E、F、G組AKP活力較A組均增高。在24 h，E組和F組的AKP活力分別為10.52±2.26和12.24±1.43，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.43±1.41)(P<0.05)。在48 h， E、F組的AKP活力分別為11.81±0.56、13.05±0.86，相比A組的9.89±0.24有顯著的提升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。F組的AKP活力值在24 h和48 h均最高。(見圖4)。

2.4 功能蛋白表達(dá)檢測(cè)

HS對(duì)Collagen I和Runx-2蛋白表達(dá)的影響，Western blot 結(jié)果顯示，50 μg/mL HS作用24 h和48 h后與對(duì)照組相比，Runx-2和Collagen I蛋白的表達(dá)均顯著升高；100 μg/mL HS作用24 h和48 h后與對(duì)照組相比，Runx-2和Collagen I蛋白的表達(dá)均降低。(見圖5)。

圖5 蛋白免疫印跡檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)Collagen I和Runx-2蛋白的表達(dá)量Fig.5 The expression of Collagen I and Runx-2 protein in osteoblasts detected by Western blot

圖6 不同濃度的HS作用于成骨細(xì)胞14 d后礦化結(jié)節(jié)數(shù)目(×40)Fig.6 The numbers of mineralized nodules in osteoblasts at 14 days with different concentrations of HS(×40)

2.5 細(xì)胞礦化能力檢測(cè)

如表1所示，細(xì)胞培養(yǎng)14 d后按茜素紅法染色，B、C、D、E、F組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯高于A組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而G組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目低于A組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表1、圖6)。

表1 茜素紅法測(cè)定HS對(duì)成骨細(xì)胞基質(zhì)礦化的影響Table 1 Effect of HS on matrix mineralization in osteoblasts by alizarin red method

注：與對(duì)照組(A組)比較，*P<0.05

3 討論

骨骼作為一個(gè)動(dòng)態(tài)的、有自我更新和再生能力的器官，理論上骨缺損愈合需要6～8 w時(shí)間，但臨床上部分缺損常因年齡、骨折部位、骨膜剝離程度等因素延遲愈合甚至不能愈合，嚴(yán)重影響患者的活動(dòng)功能和生活質(zhì)量。既往研究發(fā)現(xiàn)，HSPGs作為廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面和細(xì)胞基底膜的蛋白多糖，對(duì)于骨基質(zhì)的構(gòu)成和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用[11]。并且在骨損傷修復(fù)早期，多種HSPGs的基因表達(dá)均顯著上調(diào)[12]，這些結(jié)果均間接論證了HS在骨愈合方面重要的參與作用。

近年來有關(guān)研究表明，HS可以刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖，以及各類間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[13]。HSPGs除了自身可以參與構(gòu)成骨基質(zhì)外，還可調(diào)控MC3T3-E1的黏附遷移[4]，與骨激活素(osteoactivin,OA)的結(jié)合可激活黏附斑激酶信號(hào)通路(focal adhesion kinase,FAK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶通路(extracellular signal-regulated kinase 2,ERK1/2)，介導(dǎo)酪氨酸磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致黏著斑的形成，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附至OA基質(zhì)[14]。而OA作為一種黏附分子，可經(jīng)整合素傳遞細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)成分與力學(xué)狀態(tài)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞信號(hào)和功能的變化。Jackson等[15]利用HS對(duì)大鼠股骨中段骨折進(jìn)行治療，結(jié)果顯示5 μg HS應(yīng)用于骨折部位，2 w后可見骨小梁體積增加20%，并且AKP、Runx-2 等成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物以及多種肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子的表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)HS成骨的優(yōu)越性。

就成骨而言，AKP、Runx-2及Collagen I均是成骨細(xì)胞最重要的功能活性蛋白。AKP的高活性表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志，因此其測(cè)定值可以直接反映成骨細(xì)胞的分化能力。此外，AKP可以分解有機(jī)物中的磷酸鈣鹽，增加局部磷脂和游離鈣離子(Ca2+)的濃度，由于磷脂與Ca2+有很強(qiáng)的親和力，而AKP可使兩者沉積于類骨質(zhì)中，有助于成骨細(xì)胞基質(zhì)的礦化[16]。Runx-2是Runt轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，已被證明是胚胎發(fā)生階段骨形成模式和成骨細(xì)胞分化進(jìn)程必不可少的一種轉(zhuǎn)錄因子[17,18]。Runx-2蛋白在成骨細(xì)胞分化和骨形成方面有重要作用。它可以通過與其靶基因上的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因活性，并且直接刺激骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中骨鈣素、Collagen I及骨鈣素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[19,20]。成骨細(xì)胞的一大特征是合成Collagen I，作為骨膠原的主要組份Collagen I表面存在充分的礦化位點(diǎn)，利于礦化結(jié)節(jié)形成。同時(shí)Collagen I亦能對(duì)BMSCs發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用[21]。

本文應(yīng)用酶消化法和差速貼壁法獲得大鼠成骨細(xì)胞，鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。主要研究了不同濃度的HS對(duì)乳鼠顱骨成骨細(xì)胞的成骨增殖、分化及基質(zhì)礦化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，從CHP中提純制備的HS能促使乳鼠顱骨成骨細(xì)胞AKP、Runx-2以及Collagen I這些成骨分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)量明顯增加，對(duì)細(xì)胞分化能力有正性作用。50 μg/mL HS作用24 h和48 h后與對(duì)照組相比，Runx-2和Collagen I的表達(dá)均升高，說明此濃度為細(xì)胞成熟的適宜濃度，在此濃度下HS可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化成熟。而100 μg/mL HS作用24 h和48 h后與對(duì)照組相比，Runx-2和Collagen I的表達(dá)均降低，這可能與高濃度的HS產(chǎn)生了細(xì)胞毒性或者激發(fā)了某種特殊負(fù)反饋機(jī)制從而抑制乳鼠成骨細(xì)胞的分化能力有關(guān)。

Manton等[22]利用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法和細(xì)胞匯合前后倍增時(shí)間的評(píng)估方法，得出從正常成年人成骨細(xì)胞表面和基質(zhì)中提取的HS能夠抑制人成骨細(xì)胞的增殖的結(jié)論，而這種抗增殖作用只有在細(xì)胞增殖的初始線性相位以及當(dāng)HS濃度大于500 ng/mL時(shí)才會(huì)發(fā)生。本研究采用的HS濃度均超過500 ng/mL，與正常對(duì)照組相比，HS作用的各組成骨細(xì)胞在48 h及96 h 時(shí)MTT檢測(cè)吸光度普遍較低。HS對(duì)乳鼠顱骨成骨細(xì)胞的增殖能力顯示出抑制作用，這與Manton的增殖的結(jié)果相符。但另外一方面，這種抑制并不完全。結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組96 h的吸光度均高于48 h，說明在兩次時(shí)間點(diǎn)之間細(xì)胞仍然存在增殖趨勢(shì)，在所研究濃度范圍內(nèi)HS并不影響成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)，而可能HS加快了細(xì)胞由增殖型轉(zhuǎn)變?yōu)榉只?，成骨?xì)胞總體數(shù)量增幅降低但成熟細(xì)胞數(shù)量增加，即HS是促進(jìn)乳鼠顱骨成骨增殖分化的過渡物。

對(duì)于成骨細(xì)胞基質(zhì)的礦化，我們的研究結(jié)果顯示所有的50 μg/mL以內(nèi)的HS加藥組均出現(xiàn)了比對(duì)照組明顯增高的礦化結(jié)節(jié)數(shù)。當(dāng)HS的濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，其促礦化作用最強(qiáng)，而當(dāng)HS濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，成分對(duì)成骨基質(zhì)的礦化能力顯示出一定程度的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面論證了HS<100 μg/mL范圍內(nèi)HS可以顯著增強(qiáng)乳鼠成骨細(xì)胞的礦化能力，另一方面提示高濃度的HS可能對(duì)基質(zhì)礦化能力存在負(fù)性作用。

綜上述，本研究可得出，高于1 μg/mL 濃度的HS可抑制乳鼠顱骨成骨細(xì)胞的增殖，并通過促進(jìn)AKP、Runx-2以及Collagen I等蛋白的表達(dá)使細(xì)胞由正常的增殖型轉(zhuǎn)變?yōu)榉只?，加快成骨?xì)胞的成熟和胞外基質(zhì)的礦化。雖然HS增殖的抑制作用與其濃度并無顯著關(guān)聯(lián)，促分化及礦化的作用卻與HS濃度明顯相關(guān)。HS促成骨細(xì)胞活性作用的最適濃度為50 μg/mL。