甲狀旁腺素促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折大鼠Ⅰ型膠原代謝的研究

孫明曜 曾弈 沈彬*

1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029

甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是一類能夠調(diào)節(jié)骨代謝的激素[1-2]。在臨床上，小劑量的甲狀旁腺素能夠有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松，無論是特立帕肽[PTH(1-34)，一段包含了34個(gè)氨基酸的PTH內(nèi)源性片段]，還是全長的PTH(1-84)，都能夠有效減少骨質(zhì)疏松骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。另一方面，對于已經(jīng)發(fā)生了骨質(zhì)疏松骨折的患者，間斷低劑量的使用PTH可以縮短骨折愈合的時(shí)間，改善愈合效果[5-7]，甚至對于部分骨缺損的修復(fù)，也有良好的促進(jìn)效果[8-9]。

骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)不僅僅受骨密度影響，更取決于骨強(qiáng)度的變化。Ⅰ型膠原作為構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，它的含量和排列結(jié)構(gòu)密切影響著骨基質(zhì)的質(zhì)量、骨構(gòu)架形成以及骨的強(qiáng)度[10]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松患者的骨組織中，Ⅰ型膠原含量有著不同程度的減低，其排列結(jié)構(gòu)也變得紊亂[11-12]。故Ⅰ型膠原與骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松骨折之間有著密切的聯(lián)系。COL1A1是編碼Ⅰ型膠原α1鏈的基因。通過對COL1A1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測，可以推測Ⅰ型膠原代謝的動(dòng)態(tài)過程，并判斷Ⅰ型膠原含量的變化趨勢。所以COL1A1基因的檢測也是研究Ⅰ型膠原變化趨勢的一項(xiàng)重要手段。不過有關(guān)PTH對Ⅰ型膠原及COL1A1影響的研究，尤其在骨質(zhì)疏松性骨折中的研究，目前文獻(xiàn)報(bào)道尚少。

因此本研究擬通過建立骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型，在PTH(1-34)的干預(yù)下，檢測骨折斷端標(biāo)本HE染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色及COL1A1 mRNA表達(dá)水平，并與對照組對比，進(jìn)而探討骨折愈合過程中PTH影響下Ⅰ型膠原代謝的變化。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠骨質(zhì)疏松模型

選取清潔級SD雌性成年大鼠，體重(300±50)g，分為手術(shù)組(OVX組)及假手術(shù)組(Sham組)，OVX組大鼠切除雙側(cè)卵巢，Sham組僅做背部切口，不切除卵巢。術(shù)后3個(gè)月，取手術(shù)組及假手術(shù)組各5只，測定骨密度，觀察模型是否建立成功。

1.2 建立大鼠脛骨骨折內(nèi)固定模型

OVX組大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功后，于脛骨中上段1/3處鋸斷雙側(cè)脛骨，并以克氏針行脛骨髓腔髓內(nèi)固定。即建立大鼠脛骨骨折內(nèi)固定模型。術(shù)后于手術(shù)切口及克氏針針眼處涂抹紅霉素藥膏，并肌注頭孢呋辛(30 mg/100 g)預(yù)防感染。

1.3 分組與取材

將64只骨質(zhì)疏松脛骨骨折模型大鼠隨機(jī)分為兩組，每組32只。A組(PTH組)予以特立帕肽3 μg/(100 g·d)皮下注射，每天一次；B組(NS組)予以等量生理鹽水皮下注射，每天一次。自第一天給藥起，分別于第1、2、4、8 周隨機(jī)選取A組及B組大鼠各8只進(jìn)行取材。處死大鼠后，取雙側(cè)脛骨標(biāo)本，拔除內(nèi)固定物，一部分脛骨存放于液氮，用RT-PCR檢測COLIA1mRNA的表達(dá)水平；另一部分固定于4%多聚甲醛，行HE染色及免疫組化染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松模型的建立

大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)后3個(gè)月，取OVX手術(shù)組大鼠及Sham假手術(shù)組大鼠各5只，在雙能X線吸收儀上測定其脛骨中上份骨密度。OVX大鼠骨密度：(0.2512±0.0316) g/cm2，Sham組大鼠骨密度：(0.3438±0.0296) g/cm2。OVX大鼠骨密度比Sham組大鼠骨密度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.99，P<0.05)，骨質(zhì)疏松模型建立成功。

2.2 骨折模型建立及藥物干預(yù)后的指標(biāo)檢測

2.2.1大鼠脛骨骨折斷端組織COLIA1mRNA合成量：計(jì)算COLIA1基因與管家基因相比的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在PTH大鼠的脛骨標(biāo)本中，COL1A1 mRNA的表達(dá)有著明顯的升高，差異與NS組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，在第8周時(shí)仍沒有衰減的征象。各組大鼠的COL1A1 mRNA合成對比見表1，時(shí)間趨勢見圖1。

2.2.2大鼠脛骨骨折斷端HE染色及Ⅰ型膠原免疫組化染色：骨折術(shù)后第2周，HE染色可見：PTH組大鼠骨折斷端已趨向閉合，骨折線處有相對于NS組大鼠更多的軟骨細(xì)胞；NS組大鼠骨折斷端之間尚有殘存的裂隙，纖維骨痂部分?jǐn)嗔?。Ⅰ型膠原免疫組化可見：PTH組大鼠骨折線軟骨層的邊緣已部分骨化，軟骨層中心可見部分新生的Ⅰ型膠原纖維；而NS組大鼠骨痂組織中未看到新生Ⅰ型膠原的表達(dá)。術(shù)后第4周HE染色：PTH組大鼠骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞數(shù)量相對較多，骨折線兩側(cè)的骨微結(jié)構(gòu)排列一致有序；NS組大鼠骨痂形態(tài)欠佳，軟骨細(xì)胞少，骨折線兩側(cè)骨微結(jié)構(gòu)紊亂、不對稱。Ⅰ型膠原免疫組化：PTH組大鼠骨痂中有大量Ⅰ型膠原纖維形成，膠原纖維的排列方向均勻一致，呈現(xiàn)出自骨痂中線向骨痂邊緣的對稱性增強(qiáng)；NS組大鼠的骨痂組織中幾乎看不到Ⅰ型膠原的染色。到第8周，兩組大鼠的骨折斷端都已經(jīng)閉合，PTH組大鼠骨痂已基本完全骨化，殘存的軟骨細(xì)胞極少，已經(jīng)觀察不到成束的Ⅰ型膠原纖維，僅見大片已修復(fù)良好的骨基質(zhì)；而NS組大鼠骨痂內(nèi)尚殘存部分未骨化的軟骨細(xì)胞， 骨折線兩側(cè)還能觀察到血管翳的長入(圖2～4)。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)COL1A1 mRNA的相對表達(dá)量Table 1 The relative expression levels of COL1A1 mRNA in the two groups of rats at different time points

圖2 骨折術(shù)后2 w PTH組與NS組大鼠脛骨骨折斷端切片。A：PTH組大鼠HE染色；B：NS組大鼠HE染色；C：PTH組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化；D：NS組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化Fig.2 The tibial slices of the PTH group and the NS group of rats 2 weeks after fracture surgery. A: HE staining of the PTH group of rats; B: HE staining of the NS group of rats; C: IHC staining of the PTH group of rats; D: IHC staining of the NS group of rats.

圖1 兩組大鼠COL1A1 mRNA相對表達(dá)量隨時(shí)間變化趨勢圖Fig.1 The relative expression levels of COL1A1 mRNA in the two groups of rats at different time points

圖3 骨折術(shù)后4 w PTH組與NS組大鼠脛骨骨折斷端切片。A：PTH組大鼠HE染色；B：NS組大鼠HE染色；C：PTH組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化；D：NS組大鼠Ⅰ型膠原免疫組化Fig.3 The tibial slices of the PTH group and the NS group of rats 4 weeks after fracture surgery. A: HE staining of the PTH group of rats; B: HE staining of the NS group of rats; C: IHC staining of the PTH group of rats; D: IHC staining of the NS group of rats.

3 討論

甲狀旁腺素的基本功能是維持血鈣的平衡，促進(jìn)磷酸鹽及維生素D3的重吸收，以及調(diào)節(jié)骨的代謝[1-2，8]。已有研究證實(shí)，PTH對骨代謝的調(diào)節(jié)為雙向作用，長期大量的分泌將導(dǎo)致骨的過分吸收與破壞，但是間斷規(guī)律地給予PTH，反而可以增加新骨的生成[13-14]。這種研究是通過檢測骨代謝標(biāo)記物Ⅰ型前膠原氨基末端前肽(procollagenⅠN-terminal peptide，PINP)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(typeⅠcollagen carboxyl terminal peptide，CTX-Ⅰ)等進(jìn)行的。這些標(biāo)記物恰是Ⅰ型膠原代謝的產(chǎn)物，這在側(cè)面也反映了Ⅰ型膠原的代謝與骨代謝密不可分。正如前文所述，Ⅰ型膠原的含量和排列結(jié)構(gòu)共同影響著骨基質(zhì)的質(zhì)量，以及骨的強(qiáng)度。另外有研究報(bào)道，在股骨頸骨折患者的骨折部作骨結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)其板層骨的厚度發(fā)生了變化，提示在骨折處發(fā)生了Ⅰ型膠原排列的紊亂[15]。這表明在骨折斷端，Ⅰ型膠原的排列會(huì)產(chǎn)生一定的影響。那么，在應(yīng)用了PTH之后，Ⅰ型膠原的排列是否會(huì)得到有效的改善呢？目前尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。而編碼Ⅰ型膠原α1鏈的基因正是COL1A1基因，通過對COL1A1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測，可以推測Ⅰ型膠原代謝的動(dòng)態(tài)過程，并判斷Ⅰ型膠原含量的變化趨勢。綜上，筆者設(shè)計(jì)了此實(shí)驗(yàn)，通過PTH干預(yù)脛骨骨質(zhì)疏松性骨折的大鼠，觀察并檢測骨折斷端Ⅰ型膠原的表達(dá)及排列，以及COL1A1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，從而分析PTH對骨質(zhì)疏松性骨折過程中Ⅰ型膠原代謝的影響。

通過對骨折斷端的染色觀察發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，PTH影響下的Ⅰ型膠原不僅表達(dá)更快、更多，其排列結(jié)構(gòu)也更為有序。此前也曾有人進(jìn)行過類似的研究。Ascenzi等[16]曾對接受PTH治療的骨質(zhì)疏松女性的皮質(zhì)骨進(jìn)行了高倍率的光學(xué)及電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在PTH組患者的骨組織中，Ⅰ型膠原排列更為有序、方向更為一致，由此促成了更厚的皮質(zhì)骨板層。這與本研究觀察的結(jié)果是相符合的。不過Ascenzi等并沒有對Ⅰ型膠原的含量進(jìn)行測定。Saito等[17]則在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了PTH注射下膠原蛋白的含量測定。他們以切除卵巢的猴子作為骨質(zhì)疏松模型，分別進(jìn)行低劑量(1.2 μg/kg)和高劑量(6.0 μg/kg)hPTH(1-34)每周一次的注射，18個(gè)月后監(jiān)測其腰椎椎體的膠原含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低劑量PTH組中，腰椎椎體內(nèi)膠原含量明顯高于對照組。然而Saito等的實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性。首先，他們所測定的“膠原”不能明確是單純的Ⅰ型膠原，而很有可能是多亞型膠原的混合；其次，他們的監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)只有一處，不能很好地反映膠原代謝的動(dòng)態(tài)變化。Kakar等[18]曾對建立了股骨骨折模型的雄性小鼠進(jìn)行了為期14 d的PTH(1-34)間斷注射，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)中，與軟骨生成和骨生成相關(guān)的基因表達(dá)升高了3倍，這提示PTH可以促進(jìn)骨折愈合過程中軟骨的增殖和分化。本研究的HE染色和免疫組化染色結(jié)果也印證了Kakar等的推斷，提示PTH能夠有效地加強(qiáng)骨折愈合過程中軟骨內(nèi)成骨的作用。

本研究還采用了熒光定量PCR的方法，檢測了骨痂附近骨組織內(nèi)COL1A1 mRNA的相對含量。在前人的研究中，直接研究PTH對大鼠COL1A1基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)很少見。McClelland 等[19]對雄性大鼠進(jìn)行了持續(xù)5 d、每天一次(40 ug/kg)的hPTH(1-34)注射，然后對其股骨遠(yuǎn)端干骺端的骨組織進(jìn)行DDRT-PCR擴(kuò)增，在其中檢測到了COL1A1 mRNA的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)對于探索PTH與COL1A1關(guān)系具有很好的指導(dǎo)意義，但是也存在不足。首先他們沒有和對照組進(jìn)行表達(dá)量的對比；其次實(shí)驗(yàn)大鼠不是骨質(zhì)疏松模型，不能排除其基線水平的差異；再次，由于干預(yù)時(shí)間過短，不能體現(xiàn)COL1A1水平的變化趨勢。本研究借鑒McClelland 等人的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，將大鼠隨機(jī)分組，在給藥之前檢測了COL1A1的基線表達(dá)水平，并將研究時(shí)間增加至8 w。最終通過COL1A1表達(dá)時(shí)間趨勢圖發(fā)現(xiàn)PTH組大鼠的COL1A1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平有著明顯的升高，這印證了McClelland 等人的研究結(jié)果，也側(cè)面反映了Ⅰ型膠原的表達(dá)是活躍的。

綜上所述，本研究通過觀測PTH干預(yù)下骨質(zhì)疏松骨折大鼠的愈合，證實(shí)了PTH可以加強(qiáng)骨折斷端Ⅰ型膠原的代謝，促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成和重塑，從而有效增加骨痂組織Ⅰ型膠原的含量和結(jié)構(gòu)排列。這提示了PTH可以通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原的代謝增加骨的強(qiáng)度，從而有效地治療骨質(zhì)疏松。