低分子肝素與普通肝素對(duì)慢性腎臟病大鼠腎性骨病及血管鈣化影響的比較研究

孟彥 張豪 賀寧 石東英 趙建榮 李青南 左力

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)部，湖北 十堰 442000 3.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 4.廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所/廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663 5.北京大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100044

普通肝素(unfractionated heparin，UFH)和低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是血液透析時(shí)應(yīng)用最廣泛的抗凝劑。既往研究表明，長(zhǎng)期應(yīng)用普通肝素可以導(dǎo)致正常大鼠、患有抗磷脂綜合征的妊娠婦女和下肢深靜脈血栓患者出現(xiàn)骨丟失[1-3]。筆者的既往研究提示，普通肝素可以引起慢性腎臟病大鼠的松質(zhì)骨骨量減少和骨密度(bone mineral density，BMD)減低[4]。

然而，低分子肝素是否會(huì)引起正常人骨質(zhì)減少這一問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議，低分子肝素對(duì)于進(jìn)入血液透析應(yīng)用抗凝劑之前就已經(jīng)存在腎性骨病的慢性腎臟病患者骨代謝的影響更是一個(gè)未知領(lǐng)域。鑒于此，筆者利用腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)大鼠模型觀(guān)察了低分子肝素對(duì)CKD時(shí)腎性骨病的影響，并與普通肝素的作用進(jìn)行比較。另外，由于在CKD時(shí)，腎性骨病、血管鈣化和礦物質(zhì)代謝相關(guān)血清生化標(biāo)志物異常是相互影響的3個(gè)方面，因此筆者也在同一模型上觀(guān)察了低分子肝素和普通肝素對(duì)于CKD時(shí)血管鈣化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

低分子肝素來(lái)源于輝瑞制藥的達(dá)肝素鈉注射液。動(dòng)物飼料在北京科澳協(xié)力飼料公司定制，以AIN-93純化飼料配方[5]為基礎(chǔ)，第1種含腺嘌呤0.75%，第2種不含腺嘌呤。兩種飼料均含鈣1.11%、磷1.03%、酪蛋白9%。50只13 w齡雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

經(jīng)過(guò)1 w適應(yīng)性飼養(yǎng)后，50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。(1)正常對(duì)照(Normal)組，第3、4、5周皮下注射生理鹽水0.5 mL/d,6 d/w；(2)慢性腎臟病(CKD)組，第3、4、5周皮下注射生理鹽水0.5 mL/d,6 d/w；(3)慢性腎臟病普通肝素(CKD Heparin)組，第3、4、5周皮下注射普通肝素2 U/(g·d),6 d/w；(4)慢性腎臟病低劑量低分子肝素(CKD L-LMWH)組，第3、4、5周皮下注射低分子肝素1.25 U/(g·d),6 d/w；(5)慢性腎臟病高劑量低分子肝素(CKD H-LMWH)組，第3、4、5周皮下注射低分子肝素2.5 U/(g·d),6 d/w。實(shí)驗(yàn)中大鼠共飼養(yǎng)6 w，Normal組大鼠喂以不含腺嘌呤的飲食6 w，其余5組大鼠前4 w喂以含有腺嘌呤的飲食，后2 w喂以不含腺嘌呤的飲食。

第2周末，采血行血清生化標(biāo)志物檢測(cè)。第6周末，麻醉后處死所有大鼠。留取血清標(biāo)本后再留取從升主動(dòng)脈起始部到腹腔干上緣部分的主動(dòng)脈。分離雙側(cè)股骨及第5腰椎，第5腰椎先后進(jìn)行骨密度和生物力學(xué)檢測(cè)，右側(cè)股骨骨密度檢查，左側(cè)股骨生物力學(xué)檢測(cè)。

1.3 生化標(biāo)志物檢測(cè)

血清肌酐、尿素氮、鈣、磷由日立7170S生化分析儀完成檢測(cè)。血清甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)采用美國(guó)Immutopics公司大鼠全段PTH ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.4 血管鈣、磷含量的測(cè)定

將從升主動(dòng)脈起始部到腹腔干上緣的主動(dòng)脈沿縱軸剖開(kāi)，65 ℃烘箱中干燥72 h，稱(chēng)重。1 mL純硝酸和0.1 mL純高氯酸溶解，加熱到180 ℃使溶液變?yōu)榻Y(jié)晶。用超純水將結(jié)晶溶解并定容到2 mL后用iCAP6300型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定血管鈣、磷含量。結(jié)果用鈣(mg)/干血管(g)或磷(mg)/干血管(g)表示。

1.5 骨密度檢測(cè)

用美國(guó)Hologic公司的QDR-Discovery型骨密度儀完成離體骨的骨密度檢測(cè)。除測(cè)量整個(gè)股骨的骨密度外，另外選擇兩個(gè)感興趣區(qū)(region of interest，ROI)(圖1)，分別為ROI 1(R1)和ROI 2(R2)。R1由皮質(zhì)骨構(gòu)成，為股骨小轉(zhuǎn)子下方0.5 cm長(zhǎng)的一段股骨干；R2由皮質(zhì)骨和小梁骨構(gòu)成，主要由小梁骨構(gòu)成，位于股骨遠(yuǎn)端干骺端生長(zhǎng)板上方0.17 cm的一個(gè)面積為0.12 cm2的正方形區(qū)域，不包括兩側(cè)的皮質(zhì)骨。第5腰椎在剔除椎弓后進(jìn)行骨密度檢測(cè)。

圖1 股骨骨密度檢查感興趣區(qū)(圖片來(lái)源于參考文獻(xiàn)[4])Fig.1 Regions of interest for femur bone densitometry(Figure comes from reference [4])

1.6 生物力學(xué)檢測(cè)

第5腰椎椎體和左側(cè)股骨分別進(jìn)行腰椎壓縮試驗(yàn)和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。第5腰椎檢測(cè)前去除椎弓，用砂紙磨去椎體上下面的軟骨及皮質(zhì)骨，顯露出松質(zhì)骨。用MTS力學(xué)試驗(yàn)機(jī)壓縮至椎體出現(xiàn)壓縮骨折或股骨斷裂，記錄載荷-變形曲線(xiàn)。測(cè)試時(shí)室溫為25 ℃，濕度為50%～60%，加載速度為3 mm/min，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)跨距為18 mm。生物力學(xué)的計(jì)算公式主要參考Sato等[6]的研究。結(jié)構(gòu)力學(xué)采集參數(shù)最大載荷(Maximum load)和剛度(Stiffness)，材料力學(xué)采集參數(shù)最大應(yīng)力(Maximum stress)和彈性模量(Elastic modulus)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重及生化結(jié)果

各組大鼠體重變化見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中CKD Heparin、CKD L-LMWH、CKD H-LMWH組各有一只大鼠死于內(nèi)臟出血。各組大鼠生化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)CKD、CKD Heparin、CKD L-LMWH、CKD H-LMWH組間比較各參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠體重變化曲線(xiàn)注：5組大鼠進(jìn)行連續(xù)測(cè)量的方差分析P<0.01，多重比較Normal組與其余4組任一組比較P均<0.01。Fig.2 Body weight variation curve of rats in each groupNote: P<0.01 among the five groups in repeatedly measured analysis of variance and P<0.01 in the post hoc multiple comparisons between Normal group and any one of the other four groups.

表1 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清生化標(biāo)志物比較Table 1 Comparison of rat serum biochemical markers at two time points

注：Cr，血肌酐；Urea，尿素氮；Ca，血鈣；P，血磷；PTH，甲狀旁腺激素。ND：未做檢測(cè)；a表示同一時(shí)間點(diǎn)與Normal組比較，P<0.05；aa表示同一時(shí)間點(diǎn)與Normal組比較，P<0.01。

Note: Cr, Creatinine; Urea, Blood urea nitrogen; Ca, Calcium; P, Phosphorus; PTH, Parathyroid hormone. ND, not done;a:P<0.05 compared with Normal group for each time point;aa:P<0.01 compared with Normal group for each time point.

2.2 各組大鼠血管鈣、磷含量測(cè)定結(jié)果

各組大鼠血管鈣、磷含量測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常組比較，各CKD組的血管鈣、磷含量均顯著升高，而各CKD組間比較血管鈣、磷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 各組大鼠血管鈣、磷含量。A：血管鈣含量；B：血管磷含量注：aa表示與Normal組比較，P<0.01。Fig.3 Vascular calcium and phosphorus contents of rats in each group. A: Blood vessel calcium content; B: Blood vessel phosphorus content.Note: aa: P<0.01 compared with Normal group.

2.3 各組大鼠骨密度檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠骨密度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。與CKD組比較，CKD Heparin組的股骨平均骨密度、R2骨密度明顯降低[分別為(0.249±0.014) g/cm2vs (0.216±0.016) g/cm2，P<0.01和(0.200±0.019) g/cm2vs (0.146±0.023) g/cm2，P<0.01]。與CKD Heparin組比較，CKD L-LMWH組的股骨平均骨密度、R2骨密度均明顯升高[分別為(0.216±0.016) g/cm2vs (0.242±0.011) g/cm2，P<0.05和(0.146±0.023) g/cm2vs (0.183±0.022) g/cm2，P<0.01]。與CKD Heparin組比較，CKD H-LMWH組的R2骨密度明顯升高[(0.146±0.023) g/cm2vs (0.178±0.018) g/cm2，P<0.05]。與CKD組比較，CKD Heparin組的第5腰椎骨密度明顯降低[(0.135±0.014) g/cm2vs (0.112±0.019) g/cm2，P<0.05]。與CKD Heparin組比較，CKD L-LMWH組和CKD H-LMWH組的第5腰椎骨密度均明顯升高[分別為(0.112±0.019) g/cm2vs (0.139±0.017) g/cm2，P<0.05和(0.112±0.019) g/cm2vs (0.140±0.018) g/cm2，P<0.05]。

圖4 第6周末各組大鼠骨密度數(shù)據(jù)。A：股骨平均BMD；B：股骨R1 BMD；C：股骨R2 BMD；D：第5腰椎椎體BMD注：a表示與Normal組比較，P<0.05；aa表示與Normal組比較，P<0.01；b表示與CKD組比較，P<0.05；bb表示與CKD組比較P<0.01；c表示與CKD Heparin組，比較P<0.05；cc表示與CKD Heparin組比較，P<0.01。Fig.4 Rat bone mineral density data at the end of the sixth week. A: The average femur BMD; B: Femur ROI 1 BMD; C: Femur ROI 2 BMD; D: Fifth lumbar vertebra BMD.Note: a: P<0.05 compared with Normal group; aa: P<0.01 compared with Normal group; b: P<0.05 compared with CKD group; bb: P<0.01 compared with CKD group; c: P<0.05 compared with CKD Heparin group; cc: P<0.01 compared with CKD Heparin group.

圖5 第6周末各組大鼠腰椎壓縮試驗(yàn)骨生物力學(xué)參數(shù)。A：最大載荷；B：剛度；C：最大應(yīng)力；D：彈性模量注：a表示與Normal組比較，P<0.05；aa表示與Normal組比較，P<0.01；b表示與CKD組比較，P<0.05。Fig.5 Rat bone biomechanical parameters of lumbar compression tests at the end of the sixth week. A：Maximum load; B：Stiffness; C：Maximum stress; D：Elastic modulusNote: a: P<0.05 compared with Normal group; aa: P<0.01 compared with Normal group; b: P<0.05 compared with CKD group.

2.4 各組大鼠骨生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

圖6 第6周末各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)骨生物力學(xué)參數(shù)。A：最大載荷；B：剛度；C：最大應(yīng)力；D：彈性模量注：a表示與Normal組比較，P<0.05；aa表示與Normal組比較，P<0.01。Fig.6 Rat femur biomechanical parameters of 3 point bending tests at the end of sixth week. A：Maximum load; B：Stiffness; C：Maximum stress; D：Elastic modulusNote: a: P<0.05 compared with Normal group; aa: P<0.01 compared with Normal group.

各組大鼠腰椎壓縮試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。與CKD組比較，CKD Heparin組的最大載荷和剛度均明顯下降(分別為181.23±37.69 vs 100.78±37.56，P<0.05和1480.30±686.09 vs 564.1±481.06，P<0.05)。與CKD組比較，CKD Heparin組的最大應(yīng)力和彈性模量均明顯下降(分別為589.45±237.53 vs 231.04±169.78，P<0.05和15.28±3.86 vs 8.71±2.33，P<0.05)。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，各CKD組之間各參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

從本研究骨密度結(jié)果看，普通肝素可以引起慢性腎臟病大鼠松質(zhì)骨的骨密度減低，對(duì)皮質(zhì)骨的骨密度無(wú)明顯影響。該結(jié)果和筆者既往研究結(jié)果一致[4]。筆者在既往研究中，骨病理檢查提示模型的骨骼病變?yōu)槔w維性骨炎，通過(guò)形態(tài)計(jì)量學(xué)方法發(fā)現(xiàn)普通肝素可以引起慢性腎臟病大鼠松質(zhì)骨的骨量減少，而對(duì)骨礦化、骨轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)影響，對(duì)皮質(zhì)骨骨量無(wú)影響。在本研究中，低分子肝素對(duì)慢性腎臟病大鼠的皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨密度均無(wú)明顯影響。對(duì)于普通肝素和低分子肝素對(duì)正常人骨代謝的影響，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為正常人長(zhǎng)期應(yīng)用普通肝素后易出現(xiàn)骨量減少和骨質(zhì)疏松，而低分子肝素對(duì)正常人骨質(zhì)作用還不太明確，可能的情況是低分子肝素較普通肝素有較弱的導(dǎo)致骨丟失的作用或低分子肝素在治療劑量下對(duì)骨質(zhì)沒(méi)有影響[7]。最近的一篇Meta分析提示，正常人若3～6個(gè)月短期應(yīng)用低分子肝素其骨折風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加，但若2年或2年以上的長(zhǎng)期使用可能會(huì)影響骨密度[8]。而對(duì)于普通肝素和低分子肝素對(duì)于慢性腎臟病骨代謝的影響，檢索到的兩篇臨床研究均提示普通肝素可以引起長(zhǎng)期透析的患者骨密度減低，而低分子肝素作用較弱[9-10]。

骨生物力學(xué)參數(shù)直接反映骨質(zhì)量，腰椎壓縮試驗(yàn)反映松質(zhì)骨的力學(xué)性能，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)反映皮質(zhì)骨的力學(xué)性能。本研究提示，普通肝素可以降低松質(zhì)骨的材料力學(xué)和結(jié)構(gòu)力學(xué)性能，對(duì)皮質(zhì)骨的力學(xué)性能沒(méi)有影響，而低分子肝素對(duì)松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的力學(xué)性能均無(wú)影響。這一結(jié)果和本研究?jī)煞N肝素對(duì)骨密度測(cè)量結(jié)果相吻合。未檢索到普通肝素或低分子肝素對(duì)慢性腎臟病骨代謝的生物力學(xué)研究，而Folwarczna等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，高劑量普通肝素、依諾肝素、那曲肝素均可以對(duì)正常大鼠股骨生物力學(xué)性能造成不良影響。

從血管鈣、磷含量檢測(cè)結(jié)果看，普通肝素、兩個(gè)劑量的低分子肝素均對(duì)血管鈣、磷含量無(wú)明顯差異。本研究普通肝素對(duì)血管鈣、磷含量的影響結(jié)果與本課題組的既往研究一致[4]。而Yang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，普通肝素和低分子肝素可以抑制牛血管平滑肌在甘油磷酸鹽環(huán)境中向成骨細(xì)胞的分化以及細(xì)胞內(nèi)礦物質(zhì)沉積。目前觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，慢性腎臟病時(shí)的血管鈣化是一個(gè)復(fù)雜的主動(dòng)過(guò)程，各種促進(jìn)血管鈣化的因素消失或作用增強(qiáng)(如高磷血癥、高PTH血癥、氧自由基生成)，各種抑制血管鈣化的因素消失或作用減弱(如胎球蛋-A、焦磷酸鹽、基質(zhì)G蛋白等的減少)，使得血管平滑肌向成骨細(xì)胞方向分化，最終出現(xiàn)血管鈣化[13-14]。

本研究選擇臨床較為常用的達(dá)肝素鈉作為研究藥物，但臨床中各種低分子肝素存在細(xì)微的差別，如分子量、抗Xa因子與抗IIa因子活性比。目前觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為各種低分子肝素實(shí)際應(yīng)用中不良作用方面沒(méi)有差異[15]，但上述觀(guān)點(diǎn)是基于有限的研究得出，未來(lái)需要更多研究探討該問(wèn)題。

本研究表明，低分子肝素對(duì)有繼發(fā)性甲狀旁腺亢進(jìn)癥的CKD大鼠的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨密度和骨力學(xué)性能均無(wú)影響；而普通肝素可以降低松質(zhì)骨的骨密度和骨結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)性能，對(duì)皮質(zhì)骨骨密度和骨生物力學(xué)性能無(wú)影響。兩種肝素均對(duì)有繼發(fā)性甲狀旁腺亢進(jìn)癥的CKD大鼠的血管鈣化無(wú)影響。總的說(shuō)來(lái)，低分子肝素對(duì)CKD大鼠骨代謝的不良影響要低于普通肝素，兩種肝素均對(duì)CKD大鼠的血管鈣化無(wú)影響。