Bcl2及Bak1重組表達(dá)腺病毒對MG63細(xì)胞的影響

黃宏興 柴爽 黃紅 萬雷 張志海 王吉利

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。該病的發(fā)生與骨形成和骨吸收失衡密切相關(guān)，在骨重建過程中，吸收的骨量多于形成的新骨而造成骨重建脫偶聯(lián)，是骨質(zhì)疏松發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]。過去的研究多關(guān)注破骨細(xì)胞過度活化，但近年來成骨細(xì)胞功能異常在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用越來越受到重視[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中起著非常重要的作用[6]。關(guān)于細(xì)胞調(diào)亡的研究提示Bcl2(B-cell lymphoma-2)蛋白家族是調(diào)控細(xì)胞線粒體調(diào)亡途徑的關(guān)鍵因子，Bak1(BCL2-antagonist/killer 1)作為Bcl2家族的促凋亡蛋白，對線粒體凋亡途徑中線粒體外膜的通透化非常重要[7]。為進(jìn)一步研究成骨細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)疏松骨形成中的機(jī)制，本研究采用Bcl2、Bak1重組腺病毒載體單獨或共轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG63，并檢測其對細(xì)胞及相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及重組腺病毒載體：人成骨肉瘤細(xì)胞(MG63，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫提供)、Bcl2、Bak1重組腺病毒載體(本課題組前期已構(gòu)建)。

1.1.2主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Pen/Strep(均購自美國Gibco公司，批號分別為C11995500BT、10099-141、15140-122)，噻唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒、Triton-100、EGTA(美國Sigma公司，批號M2128)，堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)活性檢測試劑盒(上海碧云天生物有限公司，批號P0321)，Calcium Orange TM Indicators(美國Molecular Probes公司)，蛋白酶抑制劑/磷酸化抑制劑、ECL發(fā)光液(德國Merck公司)，抗骨橋蛋白(osteopontin，OPN)抗體、抗Runx2抗體、抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)抗體(美國Abcam公司，批號分別為ab91655、ab23981、ab6671)，抗結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體(美國Santa公司，批號Sc-25400)，羊抗兔二抗(美國Jackson公司，批號111-035-003)蛋白Marker(美國Fermentasa公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(法國NaPCO公司)酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞活性檢測：收集對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/mL。96孔板中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，設(shè)置空載腺病毒干預(yù)組(A組)、Bcl2重組腺病毒轉(zhuǎn)染組(B組)、Bak1重組腺病毒轉(zhuǎn)染組(C組)、Bcl2、Bak1重組腺病毒共轉(zhuǎn)染組(D組)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，用Bcl2、Bak1重組腺病毒單獨或共轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞(MOI=50)。轉(zhuǎn)染48 h后，棄舊培養(yǎng)基后再補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，并分別向每孔中加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，按照試劑盒說明書操作步驟測定各孔吸光度A，根據(jù)各組A計算細(xì)胞活性：(A實驗組/A正常細(xì)胞組)×100%。

1.2.2細(xì)胞ALP活性檢測：收集對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL。于6孔板中每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，同上分為4組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，用Bcl2、Bak1重組腺病毒單獨或共轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞(MOI=50)。轉(zhuǎn)染48 h后，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，12 000 rpm離心30 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量。按照ALP活性檢測試劑盒說明書操作步驟操作，在405 nm或400～415 nm范圍內(nèi)檢測各孔吸光度。按照以下公式計算堿性磷酸酶活性：由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的酶活×稀釋倍數(shù)(2.5)/蛋白濃度(μg/μL)。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測：選取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，以1×105個/孔接種到6孔板中，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，用Bcl2、Bak1重組腺病毒單獨或共轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞(MOI=50)。48 h后消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞沉淀3次。取細(xì)胞懸液，加入Calcium Orange Indicator(溶于DMSO，濃度為2 mmol/L)至終濃度為10 μmol/L，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，上機(jī)測定每管細(xì)胞懸液樣品的熒光強(qiáng)度(Ex/Em 549 nm/576 nm)，記為F值。加入10% Triton-100后再加入1 mmol/L CaCl2，吹打均勻避光孵育10 min，測定熒光值即Fmax。加入20 μL EGTA，吹打均勻后避光孵育10 min，測定熒光值即Fmin。按照公式計算細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度：[Ca2+]free=Kd×[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。公式中Kd為熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù)，Kd=185 nmol/L。

1.2.4細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白檢測：收集對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，同1.2.2步驟分組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)，48 h后消化收集細(xì)胞，加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液裂解30 min，4 ℃，12 000 rpm離心30 min，轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)冷的EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。BSA法測定總蛋白含量。計算含40μg蛋白的溶液體積即為上樣量，在蛋白標(biāo)本中加入適當(dāng)體積的5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min。進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，加入CTGF、OPN、Runx2、TNF-α抗體，4 ℃孵育過夜。用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次(每次5 min)后，加入二抗(1∶3000)，室溫下孵育30 min。采用ECL法顯色，圖像處理軟件分析各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料滿足正態(tài)性及方差齊性，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，不滿足方差齊性則采用Dunnett’sC檢驗，以P<0.05判斷為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞活性的影響

結(jié)果顯示Bcl2重組腺病毒轉(zhuǎn)染可明顯增強(qiáng)細(xì)胞活性，Bak1重組腺病毒轉(zhuǎn)染可降低細(xì)胞活性(P<0.05)，共轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)細(xì)胞活性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組重組腺病毒轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞活性、ALP活性及鈣離子濃度的影響Table 1 Comparison of the cell viability, ALP activity and Ca2+ concentration among the groups after MG63 cells being infected with recombinant

注：與A組相比，**P<0.05；與B組相比，##P<0.05；與C組相比，△△P<0.05。

2.2 重組腺病毒轉(zhuǎn)染對ALP活性的影響

重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，B組ALP活性升高，C組ALP活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，D組ALP活性雖有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

流式檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度提示與A組相比，B組鈣離子濃度降低，C組鈣離子濃度升高(P<0.05)，D組鈣離子濃度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染對成骨相關(guān)蛋白的影響

與A組比較，B組CTGF、OPN、Runx2蛋白相對表達(dá)量均明顯升高，TNF-α表達(dá)量則降低(P<0.05)，C組各蛋白相對表達(dá)趨勢與B組相反(P<0.05)，D組CTGF、Runx2相對表達(dá)量升高，OPN、TNF-α相對表達(dá)量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組重組腺病毒轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白的影響Table 2 Comparison of the protein expression among the groups after MG63 cells being infected with

注：與A組相比，**P<0.05；與B組相比，##P<0.05；與C組相比，△△P<0.05。

圖1 各組重組腺病毒轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白的影響Fig.1 Comparison of the protein expression among the groups after MG63 cells being infected with recombinant adenovirus

3 討論

Bcl2家族蛋白在調(diào)控線粒體途徑細(xì)胞凋亡中起重要作用，Bak1、Bcl2蛋白均為家族成員，其中Bcl2蛋白位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜，能夠抑制細(xì)胞的凋亡，Bak1蛋白是定位于線粒體外膜上的促凋亡蛋白成員[8]。至于促凋亡和抑凋亡Bcl2家族蛋白是如何相互作用來調(diào)控線粒體外膜的通透性和細(xì)胞色素C釋放的，一般認(rèn)為，在正常情況下，Bak1與Bcl-xl結(jié)合而受到抑制，在凋亡刺激誘導(dǎo)下，BH3-only亞家族蛋白被激活并轉(zhuǎn)移到線粒體上，與抑制凋亡蛋白Bcl2/Bcl-xl等相互作用，釋放促凋亡蛋白Bax、Bak；或BH3分子直接同Bax/Bak相互作用，在線粒體上形成蛋白孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體中釋放而誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞調(diào)亡[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bak雙缺失的細(xì)胞具有完全的細(xì)胞死亡機(jī)制，棉酚通過誘導(dǎo)Bcl2和Bcl-xl構(gòu)象變化誘導(dǎo)Bax/Bak非依賴的細(xì)胞凋亡[10]，而PAO和二萜類化合物能誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bim上調(diào)，與發(fā)生構(gòu)象變化的Bcl2相互作用形成蛋白復(fù)合體，介導(dǎo)Bax/Bak非依賴的細(xì)胞凋亡[11]。

成骨細(xì)胞具有活躍的分泌功能，能合成和分泌骨基質(zhì)中的多種有機(jī)成分，對骨生長有重要作用。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者以及脊髓損傷后骨質(zhì)疏松動物模型來源的成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞活力下降[12]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)與非骨質(zhì)疏松者相比，骨質(zhì)疏松癥患者骨骼肌線粒體通透轉(zhuǎn)換孔活性、松質(zhì)骨Bak1的表達(dá)明顯升高，Bcl2的表達(dá)則明顯降低[13-14]，意味著更多促凋亡物質(zhì)的刺激或通過，更快地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，本課題組構(gòu)建了Bcl2、Bak1重組腺病毒載體，并分別單獨或共轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG63，發(fā)現(xiàn)Bcl2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)細(xì)胞活性、ALP活性，降低鈣離子濃度；Bak1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生相反的作用；共轉(zhuǎn)染后則對MG63細(xì)胞活性、ALP活性、鈣離子濃度無明顯影響。提示過表達(dá)Bcl2可通過抑制Bax/Bak的促凋亡作用來抑制細(xì)胞凋亡，從而引起細(xì)胞活性、ALP活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。過表達(dá)Bak1可通過提高線粒體外膜通透性促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而引起降低細(xì)胞活性、ALP活性增強(qiáng)，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。當(dāng)二者共過表達(dá)時，雖然Bcl2與Bak1不直接形成聚合體，但Bak1促細(xì)胞凋亡作用與Bcl2抑細(xì)胞凋亡作用相互抵消，對MG63細(xì)胞無明顯影響作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可以影響成骨細(xì)胞活性功能[15]，當(dāng)其濃度升高時，可抑制成骨細(xì)胞的礦化能力[16]，結(jié)合本研究可說明過表達(dá)Bcl2可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性及鈣化能力、延緩成骨細(xì)胞凋亡。

OP的發(fā)生與成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成過程和破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨吸收過程密切相關(guān)，成骨細(xì)胞對骨組織的代謝平衡、生長發(fā)育和損傷修復(fù)起主要作用。其主要功能包括產(chǎn)生膠原纖維和無定形基質(zhì)形成類骨質(zhì)，分泌骨鈣蛋白、骨粘連蛋白和骨唾液酸蛋白等非膠原蛋白促進(jìn)骨組織的礦化。成骨細(xì)胞表面還存在多種骨吸收刺激因子的受體，并能分泌一些細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)骨組織形成和吸收。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中CTGF的表達(dá)，并且在其誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生胞外基質(zhì)的過程中，CTGF為其重要的下游調(diào)節(jié)器[17-18]。OPN是細(xì)胞外多功能基質(zhì)蛋白，在骨改建中多由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分泌，維持骨基質(zhì)礦化和骨吸收的平衡，介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)間的橋接[19]，常作為成骨細(xì)胞成熟階段的特異性標(biāo)志物之一[20]。Runx2屬于runt結(jié)構(gòu)域基因家族成員之一，是調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化促進(jìn)骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過調(diào)控成骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)和成骨細(xì)胞周期參與成骨細(xì)胞的分化過程[21]。TNF-α不僅能直接作用于破骨前體細(xì)胞促進(jìn)其分化，還可通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL間接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，而且能增加破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，對成骨細(xì)胞功能也有直接影響[22-23]。以上蛋白均與成骨細(xì)胞密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示Bcl2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞可提高CTGF、Runx2、OPN蛋白的相對表達(dá)量，降低TNF-α相對表達(dá)量，Bak1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染則可產(chǎn)生相反的作用；共轉(zhuǎn)染后各蛋白相對表達(dá)量無顯著性改變。提示過表達(dá)Bcl2不僅可通過抑制細(xì)胞凋亡增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性及鈣化能力，還可影響成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，具有促成骨效應(yīng)。

綜上，本研究結(jié)果提示過表達(dá)Bcl2既可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性及鈣化能力，又可影響成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，這為通過干預(yù)成骨細(xì)胞凋亡來影響骨質(zhì)疏松骨形成提供了實驗依據(jù)。