CRISPR/Cas系統(tǒng)抵御細(xì)菌耐藥

徐艷，崔玉曉，楊洋，羅義，鄭向群，毛大慶,*

1. 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071 2. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191 3. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 教育部環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

目前環(huán)境中耐藥細(xì)菌及基因普遍傳播，引起細(xì)菌耐藥污染問題受高度重視，各界學(xué)者對(duì)環(huán)境中細(xì)菌耐藥的研究也日益增多。細(xì)菌耐藥主要由質(zhì)粒、整合子等可移動(dòng)遺傳元件轉(zhuǎn)移獲得進(jìn)而傳播擴(kuò)散，且毒力或耐藥基因可能通過水平轉(zhuǎn)移到致病菌上，甚至?xí)鹦滦蛡魅静〉谋┌l(fā)和流行，由此產(chǎn)生的“超級(jí)”耐藥菌時(shí)刻威脅著人類健康。面對(duì)外源遺傳物質(zhì)(如噬菌體和質(zhì)粒)的侵入，細(xì)菌自身進(jìn)行抵御形成一個(gè)針對(duì)這些外源遺傳物質(zhì)入侵的免疫系統(tǒng)，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及相關(guān)基因(CRISPR-associated, Cas)組成的系統(tǒng)(CRISPR/Cas)具有一類獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，大多分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中[1]。早期Moineau教授在Nature期刊上發(fā)文提到，一些細(xì)菌將攜帶抗性基因的核酸片段重組到基因組中，導(dǎo)致細(xì)菌喪失接受質(zhì)粒嵌入的特性，意味著細(xì)菌獲得了對(duì)耐藥基因的免疫能力，可以抵御細(xì)菌耐藥性?？傃灾?，CRISPR系統(tǒng)建立了一套特異性的防御體系，能夠有效防御外源遺傳物質(zhì)的侵入，確保本身遺傳信息的完整性。

當(dāng)前針對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)如何防御細(xì)菌耐藥的研究尚少，Marraffini等[2-3]發(fā)現(xiàn)通過靶向DNA CRISPR系統(tǒng)干擾某特定葡萄球菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移，限制耐藥致病菌的傳播擴(kuò)散，但其機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)CRISPR/Cas進(jìn)化對(duì)水平基因轉(zhuǎn)移有抑制作用的直接證據(jù)尚且缺乏[4]。值得關(guān)注的是研究發(fā)現(xiàn)為了在環(huán)境壓力影響下生存的一些缺少CRISPR系統(tǒng)的菌株更容易獲得耐藥基因，并且缺少CRISPR系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌更容易受到噬菌體的攻擊，這一矛盾體現(xiàn)在不同種類的細(xì)菌中CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系千差萬別。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介及作用機(jī)制

CRISPR/Cas系統(tǒng)大致由CRISPR、前導(dǎo)序列以及Cas蛋白三部分共同構(gòu)成(圖1)。CRISPR由多個(gè)重復(fù)序列(Repeat)和間隔序列(Spacer)組成。其中前導(dǎo)序列與重復(fù)序列相連，可以識(shí)別新的間隔序列，啟動(dòng)前-crRNA(CRISPR RNAs)的轉(zhuǎn)錄。Cas基因家族具有多種基因亞型，位于CRISPR位點(diǎn)附近，用于編碼CRISPR的相關(guān)蛋白質(zhì)，且通過tracrRNA(trans-activating crRNA)將crRNA前體修飾為成熟的crRNA并與crRNA協(xié)同作用，共同構(gòu)筑細(xì)菌的免疫屏障。CRISPR的間隔序列在相同或者不同菌種間都會(huì)存在差異，并且多樣性較高[5-6]。

Cas基因作為CRISPR相關(guān)蛋白基因，一般來說每種CRISPR/Cas系統(tǒng)包含4～10個(gè)cas基因，串聯(lián)排列成cas基因簇[7]。由于不同的獲取形式、來源等使間隔序列具有多態(tài)性，CRISPR/Cas系統(tǒng)由多個(gè)Cas蛋白串聯(lián)構(gòu)成的復(fù)合體來產(chǎn)生免疫性。由于Cas基因數(shù)量和序列的不同，Cas蛋白具有多種差異類型。CRISPR/Cas一般分為3個(gè)類型：系統(tǒng)I、II及III[8-10]。截止2016年的統(tǒng)計(jì)，在古細(xì)菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)8 939種不同的CRISPR系統(tǒng)，約45.1%的細(xì)菌內(nèi)含有CRISRP系統(tǒng)(表1)。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為抵御外界的免疫系統(tǒng)，可從侵入的外源遺傳物質(zhì)中插入新的間隔序列，當(dāng)同一外源基因再次入侵時(shí)，會(huì)靶向裂解外源基因，從而抵抗噬菌體感染、限制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移等，為細(xì)菌提供特異性的免疫屏障[11-13]。

圖1 CRISPR/Cas的組成結(jié)構(gòu)Fig. 1 The composition structure of CRISPR/Cas

表1 CRISPR系統(tǒng)在微生物中的分布Table 1 Distribution of CRISPR system in microorganisms

CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)作用機(jī)制分三步(圖2)：(1)適應(yīng)階段，主要獲取CRISPR間隔序列。CRISPR系統(tǒng)會(huì)在前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間插入一段與外源性基因片段(原間隔序列protospacer)同源的短DNA片段，每一次插入都會(huì)伴隨重復(fù)序列的復(fù)制，形成新的重復(fù)間隔單元[14-15]。(2)表達(dá)階段，主要是crRNA前體的轉(zhuǎn)錄與crDNA的加工階段。CRISPR將會(huì)被轉(zhuǎn)錄成一段長(zhǎng)鏈的CRISPR RNA(crRNA)前體(pre-)，并且這一前體在重復(fù)序列處將會(huì)被剪切，隨后被Cas內(nèi)切酶加工成小crRNA。與Cas蛋白結(jié)合形成Cas/crRNA作用復(fù)合體[16]。(3)干擾階段，最后階段靶向定位與裂解外源性基因。crRNA作為Cas/crRNA作用復(fù)合體的導(dǎo)向，配合尋找同源的外源DNA靶標(biāo)，如果crRNA與前間區(qū)序列完成互補(bǔ)配對(duì)，靶標(biāo)將被作用的復(fù)合體降解。

圖2 CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制Fig. 2 The mechanism of CRISPR/Cas immune system

基因組編輯技術(shù)用于編輯已知的DNA序列，通過增加、刪除基因來實(shí)現(xiàn)基因功能的激活或者抑制，其中CRISPR/Cas技術(shù)是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES細(xì)胞打靶和TALEN等技術(shù)后用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除的最新基因編輯技術(shù)方法，且有效率高、速度快及定位精確的特點(diǎn)，目前該技術(shù)成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾。在醫(yī)療方面主要以CRISPR/Cas9作為“基因剪刀”用于基因編輯。目前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)能夠限制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移從而抑制耐藥的產(chǎn)生及傳播擴(kuò)散。然而對(duì)于CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥及毒力的調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研究尚少，且研究結(jié)論也不盡相同。

2 CRISPR/Cas與細(xì)菌耐藥的關(guān)聯(lián)

目前，CRISPR系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用在細(xì)菌、斑馬魚、鼠和人等基因組的修飾編輯中，尤其對(duì)CRISPR/Cas與耐藥的關(guān)系的研究逐漸深入。近幾年來，抗生素的殘留作為環(huán)境壓力影響環(huán)境中耐藥基因的產(chǎn)生、傳播與擴(kuò)散，微生物為了利于生存通過水平轉(zhuǎn)移等方式獲得耐藥性，從而增加細(xì)菌的生存優(yōu)勢(shì)，這些耐壓基因在環(huán)境菌群中的進(jìn)一步傳播對(duì)公眾健康造成了嚴(yán)重的威脅，并且研究發(fā)現(xiàn)這些環(huán)境中大多數(shù)耐藥細(xì)菌缺少CRISPR/Cas系統(tǒng)。少數(shù)耐藥菌株含有CRISPR/Cas系統(tǒng)，這可能是由于間隔序列相應(yīng)靶序列即原間隔序列發(fā)生突變，或者基因重組導(dǎo)致間隔序列丟失，導(dǎo)致CRISPR/Cas系統(tǒng)失效，該失效的系統(tǒng)與耐藥基因得以共存。研究推測(cè)在抗生素選擇長(zhǎng)期壓力下，細(xì)菌為了平衡適合度代價(jià)，細(xì)菌優(yōu)先獲得耐藥基因，保證其生存。然而無外界環(huán)境壓力或壓力較低時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)可抵抗外源基因的侵入進(jìn)行免疫防御，保證細(xì)菌自身遺傳物質(zhì)的完整及穩(wěn)定性。

目前，研究人員把靶向特定耐藥基因(例如編碼抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的NDM-1、SHV-18基因)序列的gRNA，通過構(gòu)建的2種載體(如攜帶CRISPR元件的基因工程菌或注入CRISPR基因的噬菌體顆粒)將其導(dǎo)入細(xì)菌中，對(duì)含有的耐藥性和致病性的基因進(jìn)行定位剪切，使其失活，進(jìn)而使攜帶有害基因的細(xì)菌死亡。Bikard等[17]構(gòu)建了以受體菌上一段耐藥基因?yàn)榘袠?biāo)的CRIPSR元件，將攜帶此元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌后導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡。近期，有學(xué)者通過利用CRISPR系統(tǒng)的免疫抵御機(jī)制，能夠特異性地去除幾乎所有攜帶NDM-1的細(xì)菌，并且成功地靶向了另一種編碼SHV-18的抗性基因和腸道出血性大腸桿菌中的一個(gè)毒力因子[18]。此外，基于遺傳標(biāo)記技術(shù)，有研究已經(jīng)證實(shí)利用CRISPR系統(tǒng)可以從混合菌群中特異性去除某種細(xì)菌，由此為“微生物組編輯”的應(yīng)用開辟了一種新思路和方法。Alex等[19]對(duì)銅綠假單胞菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)育分布的研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠獲取耐藥基因，在重塑輔助基因組分布方面具有重要作用。我國(guó)學(xué)者薛澤潤(rùn)[20]對(duì)志賀菌中CRISPR的分布及結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)在志賀菌中是普遍存在的；不同時(shí)間分離出的志賀菌中CRISPR位點(diǎn)間隔序列分布存在一定差異，且發(fā)現(xiàn)Cas2基因的這種差異與志賀菌的耐藥程度具有一定相關(guān)性。王琳琳等[21]對(duì)志賀菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥的志賀菌中，CRISPR系統(tǒng)中的間隔序列數(shù)目均較少，且CRISPR/Cas系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)多種插入序列，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列數(shù)目較少而相應(yīng)攜帶耐藥基因的數(shù)量卻較多，經(jīng)過接合轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥后，相關(guān)的Cas基因堿基發(fā)生突變，充分證明志賀菌的耐藥性與CRISPR系統(tǒng)中重復(fù)序列的變異和間隔序列的多樣性有關(guān)。此外，蔡銀強(qiáng)等[22]對(duì)沙門菌中的CRISPR系統(tǒng)與耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，該菌種存在2個(gè)穩(wěn)定的CRISPR位點(diǎn)，沙門菌利用它們能夠抵御外源遺傳物質(zhì)的入侵，同時(shí)還可介導(dǎo)本身表型改變及基因亞類的進(jìn)化。Zhang等[23]經(jīng)無抗生素壓力傳代90次后，多數(shù)志賀菌CRISPR3位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，CRISPR3位點(diǎn)與cas基因可能存在共進(jìn)化，其中部分志賀菌對(duì)抗生素的敏感表型有不同程度的增加。近期Kang等[24]利用基因編輯手段將基于聚合衍生化的CRISPR納米復(fù)合物用于靶向細(xì)菌病原體和抗生素抗性，取得了一定效果。Müller等[25]利用CRISPR/Cas9與DNA圖譜結(jié)合的手段鑒定單質(zhì)粒上的抗生素抗性基因。綜上所述，CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥間存在直接關(guān)系，為以后防止細(xì)菌耐藥提供了重要參考。

2.1 CRISPR/Cas對(duì)耐藥轉(zhuǎn)移傳播的影響

細(xì)菌耐藥以水平轉(zhuǎn)移方式為主的基因相互傳遞，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的傳播擴(kuò)散[26-27]。之前有研究對(duì)強(qiáng)毒的MRSA USA300菌株進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR位點(diǎn)中的間隔序列是由基因的水平轉(zhuǎn)移獲得的，外源遺傳物質(zhì)如質(zhì)粒DNA的基因序列整合到CRISPR位點(diǎn)，重新獲得新的間隔序列從而產(chǎn)生耐藥性。此外，Palmer和Gilmore[28]對(duì)多重耐藥的腸球菌的CRISPR系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，多耐藥腸球菌均缺乏CRISPR/Cas系統(tǒng)元件，暗示細(xì)菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)可能對(duì)阻礙耐藥傳遞具有重要作用。另外對(duì)非致病的表皮葡萄球菌的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)菌株缺乏CRISPR序列，而從臨床環(huán)境分離的RP62a表皮葡萄球菌株含有CRISPR序列，可在一定程度上抵御外源性基因的入侵[29]。進(jìn)一步研究間隔序列是否能阻止質(zhì)粒向RP62a表皮葡萄球菌轉(zhuǎn)移，Marraffini等[2]研究者將金黃色葡萄球菌中攜帶β-內(nèi)酰胺質(zhì)粒pG0400的相關(guān)核苷酸內(nèi)切酶位點(diǎn)基因沉默，產(chǎn)生突變型pG0，之后將野生型及突變型pG0均轉(zhuǎn)入2種表皮葡萄球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)到?jīng)]有CRISPR結(jié)構(gòu)的菌株中的這2種質(zhì)粒的接合效率相近，這說明CRISPR系統(tǒng)可以限制從金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移至表皮葡萄球菌的抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，該影響機(jī)制由靶DNA直接介導(dǎo)，其特異性取決于間隔序列與質(zhì)粒序列的一致性，表明細(xì)菌中CRISPR序列可通過阻礙水平轉(zhuǎn)移來抵御細(xì)菌耐藥性的傳播擴(kuò)散。這種平衡發(fā)生于CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫抵御機(jī)制與耐藥基因水平轉(zhuǎn)移之間，基于CRISPR系統(tǒng)主要抑制基因在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移的功能，CRISPR系統(tǒng)可以更清楚了解細(xì)菌耐藥譜型，明確細(xì)菌基因的水平轉(zhuǎn)移情況，通過對(duì)其結(jié)構(gòu)的修飾了解限制耐藥菌株傳播的分子響應(yīng)，為有效防控耐藥細(xì)菌的傳播擴(kuò)散提供新的思路。

2.2 CRISPR/Cas對(duì)致病性毒力基因的控制

CRISPR系統(tǒng)在免疫防御過程中遇到外源性基因產(chǎn)生新間隔序列可能導(dǎo)致細(xì)菌毒力的改變。其中細(xì)菌獲得毒力和產(chǎn)生致病性一般主要通過噬菌體感染引起，如具有致病性的菌株霍亂弧菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌等均含有編碼毒力因子的溫和噬菌體基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌的CRISPR間隔序列與噬菌體序列之間產(chǎn)生相互排斥，表明細(xì)菌中的CRISPR免疫系統(tǒng)可以通過抵御具有毒性的噬菌體入侵，干擾毒力因子在細(xì)菌間傳播。最近，Yang等[30]對(duì)32株金黃色葡萄球菌中確定的CRISPR位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)可限制細(xì)菌毒力因素的傳播擴(kuò)散。之前有研究構(gòu)建了靶標(biāo)為莢膜基因的肺炎鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的感染模型，莢膜基因是肺炎鏈球菌的毒力基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)防御干擾有效抑制了攜帶莢膜基因的質(zhì)粒進(jìn)入無毒菌株，從而避免攜帶有毒力基因的菌株向無毒菌株的水平轉(zhuǎn)移，抑制了毒力株的產(chǎn)生[17]。而Nozawa等[31]對(duì)鏈球菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)的分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR通過使噬菌體介導(dǎo)的毒力基因的轉(zhuǎn)入，導(dǎo)致了這些菌株產(chǎn)生致病性，進(jìn)一步對(duì)13株化膿性鏈球菌基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)部分菌株CRISPR/Cas系統(tǒng)中缺失cas基因，部分CRISPR位點(diǎn)的間隔序列與其他研究菌株間存在差異，暗示了噬菌體基因的高感染率可能與CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性有關(guān)。Yosef等[32]研究空腸彎曲菌強(qiáng)毒株的CRISPR系統(tǒng)，分析發(fā)現(xiàn)其CRISPR序列較短或完全缺失與細(xì)菌毒力增強(qiáng)息息相關(guān)，可導(dǎo)致嚴(yán)重腸道炎和感染后嚴(yán)重的并發(fā)癥。同樣，對(duì)腸球菌CRISPR結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)cas1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致致病島的增多[32]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)可以降低細(xì)菌的毒力，其主要利用反義RNA作用影響免疫原性膜蛋白的表達(dá)，只是該毒力調(diào)節(jié)作用所需的RNA分子在不同細(xì)菌間千差萬別[33]。

通過對(duì)多種致病菌CRISPR序列及毒力編碼基因的大量研究發(fā)現(xiàn)，Cas9基因是CRISPR/CAS系統(tǒng)中細(xì)菌毒力調(diào)控的關(guān)鍵因子[8,34]。鑒于之前的研究啟示，原理上如果生產(chǎn)一種CRISPR元件以毒力或抗性基因作為靶標(biāo)的基因藥物，它不僅能殺滅攜帶靶標(biāo)的耐藥菌株或者致病菌，還能防止耐藥或毒力基因的傳播擴(kuò)散，從而預(yù)防致病菌的大規(guī)模感染，同時(shí)也能治療被致病菌感染的人群?；诩僭O(shè)，研究者們構(gòu)建了2種不同的載體保證CRISPR元件進(jìn)到細(xì)菌中，即基因工程菌質(zhì)粒上攜帶著CRISPR基因，以及噬菌體顆粒結(jié)合細(xì)菌并具有CRISPR基因，研究成功將攜帶CRISPR基因的這2種載體轉(zhuǎn)移到耐藥菌群中，并隨后將CRISPR元件轉(zhuǎn)移到一種受感染的大蠟螟(waxworm)幼蟲體內(nèi)，結(jié)果促進(jìn)了幼蟲的生存。目前研究人員正在將此方法用于小鼠測(cè)試，預(yù)想這一方法可治療感染或是有針對(duì)性地除去患者體內(nèi)有害的細(xì)菌[18]。目前這種設(shè)想還存在著諸多需要解決的問題，但如果設(shè)計(jì)成功，那么這種藥物所具有的高度特異性可完全替代其他抗菌劑[35]。

目前研究發(fā)現(xiàn)通過利用CRISPR/Cas9在細(xì)胞DNA中的突變抑制病毒復(fù)制，仍會(huì)有些突變會(huì)促進(jìn)病毒產(chǎn)生耐藥性，因此CRISPR/Cas9抗病毒療法靶向多個(gè)病毒DNA區(qū)域顯得非常重要。Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過靶向療法殺滅許多病毒時(shí)，總會(huì)有一些病毒逃脫CRISPR/Cas9的殺滅作用產(chǎn)生耐性，對(duì)逃脫的病毒RNA進(jìn)行測(cè)序，意外發(fā)現(xiàn)大部分的病毒突變都位于Cas9促進(jìn)DNA斷裂的位點(diǎn)附近，導(dǎo)致cas9無法進(jìn)行序列的識(shí)別，因此面對(duì)這些耐藥性病毒的持續(xù)復(fù)制，CRISPR/Cas9技術(shù)用于抵御病毒的感染，仍需克服一些限制，如利用CRISPR/Cas9或除Cas9以外的其他酶類來靶向作用多個(gè)位點(diǎn)。另外，有研究表明CRISPR/Cas系統(tǒng)可以專門針對(duì)和切割保守區(qū)域的乙肝病毒基因組，從而導(dǎo)致病毒基因表達(dá)和復(fù)制的魯棒抑制[37]。Van Diemen等[38]研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯能夠高效地破壞人巨細(xì)胞病毒HCMV復(fù)制，并且研究組設(shè)計(jì)出多種gRNA能夠降低導(dǎo)致唇皰疹和皰疹性角膜炎的1型單純皰疹病毒(HSV-1)的復(fù)制，當(dāng)將其中的2種gRNA組合使用，同時(shí)靶向2種必需基因時(shí)，能夠完全抑制HSV-1復(fù)制?；谀壳暗难芯砍晒?，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于人類疾病的治愈指日可待。

2.3 CRISPR/Cas對(duì)細(xì)菌生物膜的影響

無論是工業(yè)、臨床還是生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中，細(xì)菌生物膜作為細(xì)菌的主要生長(zhǎng)型，常常導(dǎo)致一些頑固的細(xì)菌感染。其中細(xì)菌群體感應(yīng)是生物膜表型的主要表達(dá)方式。狹小的細(xì)胞間隙，為基因在細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移提供了理想的環(huán)境。一般自然條件下，微生物有2種生長(zhǎng)狀態(tài)：浮游和生物膜，細(xì)菌形成生物膜，細(xì)菌群體感應(yīng)會(huì)提高抗生素的耐受性[39]。研究表明抗生素的外界壓力下細(xì)菌易形成生物膜，增加胞外多糖的含量，同時(shí)影響穩(wěn)定細(xì)菌生物膜的三維結(jié)構(gòu)[40]。Zegans等[41]發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)CRISPR系統(tǒng)的存在對(duì)生物膜形成具有抑制作用，同時(shí)降低了細(xì)菌群聚運(yùn)動(dòng)能力，且cas基因的亞類，如cas1可編碼整合酶，可能參與新噬菌體DNA序列入侵細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)的過程，因此影響了細(xì)菌生物膜的形成及群聚運(yùn)動(dòng)等生理反應(yīng)。CRISPR介導(dǎo)的細(xì)菌生物膜的形成和群聚運(yùn)動(dòng)能力是限制噬菌體在細(xì)菌間傳播的重要機(jī)制，即被噬菌體感染的細(xì)菌將自己從生物膜及其他群體行為中隔離，這在防預(yù)細(xì)菌致病性大范圍感染方面起重要作用。Palmer等[42]的研究表明，銅綠假單胞菌生物膜的形成與CRISPR特異性插入序列有關(guān)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的存在抑制了細(xì)菌生物膜的形成，推測(cè)該特異性插入序列轉(zhuǎn)錄形成反義RNA，從而導(dǎo)致其生物膜的形成受到抑制，這說明CRISPR/Cas系統(tǒng)可調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜形成。

另外，細(xì)菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，吞噬體中的多種抗菌物質(zhì)及固有免疫反應(yīng)對(duì)其均具有殺傷作用，而該菌株CRISPR/Cas系統(tǒng)中的cas9、tracrRNA等作為調(diào)節(jié)因子，使其逃避宿主的抗菌作用。之前研究人上皮細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)cas9基因在腦膜炎奈瑟菌吸附于宿主細(xì)胞表面并侵入宿主細(xì)胞的過程中承擔(dān)重要角色[43]。另外，cas9基因的存在對(duì)空腸彎曲菌吸附入侵宿主結(jié)腸上皮細(xì)胞也同樣關(guān)鍵，表明CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。

3 展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)更新了對(duì)細(xì)菌功能調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，為防治細(xì)菌耐藥的提供了新的方向，為醫(yī)療行業(yè)有效免疫治療提供手段。目前針對(duì)CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用正如火如荼地進(jìn)行中：間隔序列顯現(xiàn)了細(xì)菌與噬菌體等外源DNA的相互過程，根據(jù)CRISPR位點(diǎn)中間隔序列的組成和排列順序，可以用來對(duì)細(xì)菌分型。CRISPR位點(diǎn)間隔序列的多態(tài)性反映出細(xì)菌的進(jìn)化歷程，可用于研究不同細(xì)菌之間的親緣關(guān)系。目前已有研究者利用這一特性對(duì)炭疽芽胞桿菌、一些芽胞桿菌等進(jìn)行分型與鑒別[44]；CRISPR/Cas9作為“基因剪刀”是目前一種熱點(diǎn)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，該技術(shù)成功應(yīng)用于微生物、斑馬魚和小鼠等動(dòng)物以及人類細(xì)胞的基因組的精確修飾；利用CRISPR系統(tǒng)的免疫干擾功能抵御噬菌體，目前已將其利用到抵御噬菌體對(duì)嗜熱鏈球菌的破壞。在近期的一項(xiàng)重大研究上已使用CRISPR/Cas9工具剪切掉CD163基因中與豬藍(lán)耳病病毒感染有關(guān)的小部分片段，培育出多頭轉(zhuǎn)基因豬。對(duì)這些豬細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)2種能引起豬繁殖與呼吸綜合病癥的子病毒具有完全抵抗力，從而能阻止感染和傳播[45]。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)控制耐藥基因在細(xì)菌水平轉(zhuǎn)移、細(xì)菌基因組編程應(yīng)用、細(xì)菌的新表型獲得，為以后分子生物領(lǐng)域研究提供重要的基因工具。CRISPR系統(tǒng)越來越受關(guān)注成為廣大學(xué)者的研究對(duì)象，并且CRISPR系統(tǒng)研究已取得了顯著成果，利用CRISPR技術(shù)對(duì)病原微生物的改造，對(duì)病毒感染的抑制，對(duì)人類感染性疾病的防治有重大意義，未來CRISPR系統(tǒng)會(huì)在人類健康和醫(yī)學(xué)發(fā)展方面將給我們更多驚喜。