莫諾苷通過(guò)AMPKα/PGC-1α/GLUT4通路對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用①

李 霞 張鐵軍 封亞麗

(河北省中醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 050011)

心血管并發(fā)癥是糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因，糖尿病性心肌病是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，其主要特征表現(xiàn)為心臟舒張功能障礙，心肌組織病變，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)增強(qiáng)等[1,2]。由于糖尿病心肌病病因及發(fā)展的多因素性，目前還沒(méi)有專門針對(duì)糖尿病心肌病的有效治療方法。尋找有效的糖尿病性心肌病治療方法對(duì)人類健康醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)具有重要意義。莫諾苷(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)是山茱萸和接骨木的主要活性物質(zhì)，屬于環(huán)烯醚萜苷類，具有抗病毒、抗氧化、抗癌及肝臟保護(hù)等活性，有利于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[3,4]。本研究主要目的是利用高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，再對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎建立糖尿病缺血再灌注模型，通過(guò)檢測(cè)大鼠心臟功能指標(biāo)、心肌梗死面積、心肌損傷標(biāo)記蛋白、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及AMPKα/PGC-1α/GLU4通路探究莫諾苷對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 60只體重200～300 g雄性SD大鼠來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。莫諾苷和STZ購(gòu)自Sigma公司。ELISA試劑盒購(gòu)自RD公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondiadehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司。抗肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)抗體、抗肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)抗體、抗肌鈣蛋白I(Troponin-I,cTn I)抗體、抗AMPKα1抗體、抗PGC-1α抗體和抗GLUT4抗體購(gòu)自Abcam公司。

圖1 莫諾苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of morroniside

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立 60只大鼠高糖飼養(yǎng)8周后，一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，72 h后血糖高于16.7 mmol/L為建模成功。隨機(jī)挑選40只糖尿病大鼠分為4組：對(duì)照組(DM)；對(duì)照加藥組(DM+莫諾苷)；模型組(I/R+DM)；加藥組(I/R+DM+莫諾苷)。對(duì)照加藥組和加藥組每天100 mg/kg 莫諾苷口服喂養(yǎng)大鼠，共25 d。對(duì)照組和模型組用生理鹽水代替莫諾苷。模型組和加藥組進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)建立缺血再灌注模型，對(duì)照組和對(duì)照加藥組進(jìn)行假手術(shù)。

1.2.2蘇木素伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色 頸椎脫臼法處死大鼠后取左心室心肌組織用PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊。用4% 的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脫水。去除酒精脫水機(jī)中脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋。切片后按照HE染色液說(shuō)明書進(jìn)行染色。光鏡下觀察心肌損傷情況。

1.2.3ELISA檢測(cè) 收集各組待測(cè)大鼠血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育45 min后用洗滌液洗滌4次，然后加入生物素標(biāo)記的抗體37℃反應(yīng)30 min，洗滌后加鏈霉親和素-HRP 混勻37℃反應(yīng)30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min后加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.4蛋白印跡 首先用PBS將待測(cè)組織細(xì)胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解進(jìn)行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜孵育，第2天加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1莫諾苷對(duì)糖尿病缺血再灌注大鼠心臟功能的影響 通過(guò)檢測(cè)各項(xiàng)心臟功能指標(biāo)和心肌梗死面積，探究莫諾苷對(duì)糖尿病缺血再灌注大鼠心臟功能的影響。圖2A～C顯示，糖尿病大鼠在缺血再灌注后平均動(dòng)脈壓(Mean arterial pressure,MAP)，心率(Heart rate,HR)和左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)明顯降低(P<0.05)。莫諾苷處理會(huì)提高糖尿病缺血再灌注大鼠MAP、HR和LVSP水平(P<0.05)。由圖2D可知，糖尿病缺血再灌注大鼠心肌梗死面積明顯大于糖尿病大鼠(P<0.05)。莫諾苷可減少糖尿病缺血再灌注大鼠心肌梗死面積(P<0.05)。上述結(jié)果表明，莫諾苷會(huì)提高糖尿病缺血再灌注大鼠心臟功能。

2.2莫諾苷對(duì)糖尿病缺血再灌注大鼠心肌組織病變的影響 通過(guò)HE染色觀察莫諾苷對(duì)糖尿病缺血再灌注大鼠心肌組織病變的影響。如圖3所示，DM組大鼠心肌組織出現(xiàn)細(xì)胞排列輕度紊亂，少數(shù)心肌纖維斷裂；DM+莫諾苷組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)致密整齊，心肌纖維完整，無(wú)心肌纖維斷裂；I/R+DM模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，多數(shù)心肌纖維斷裂；I/R+DM+莫諾苷加藥組較I/R+DM組心肌組織病變程度明顯減輕。由此可見(jiàn)， 莫諾苷可改善糖尿病大鼠缺血再灌注導(dǎo)致的心肌組織病變。

圖2 心臟功能指標(biāo)(A～C)和心肌梗死面積(D)Fig.2 Cardiac function index (A-C) and myocardial infarct area (D)Note:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

2.3莫諾苷對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 為分析莫諾苷對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷的影響，蛋白印跡檢測(cè)心肌損傷標(biāo)記蛋白Mb、CK-MB和cTn I的表達(dá)。由圖4可知，缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致Mb、CK-MB和cTn I表達(dá)升高(P<0.05)。莫諾苷處理可降低缺血再灌誘導(dǎo)的Mb、CK-MB和cTn I表達(dá)的增強(qiáng)(P<0.05)。上述結(jié)果表明，莫諾苷可抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷標(biāo)記蛋白Mb、CK-MB和cTn I表達(dá)的上升。

2.4莫諾苷可降低糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 通過(guò)ELISA檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，分析莫諾苷對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。圖5顯示，I/R+DM模型組促炎因子TNF-α和 IL-6水平明顯高于DM組，抗炎因子IL-10水平明顯低于DM組(P<0.05)。與I/R+DM模型組相比，加藥組TNF-α和 IL-6水平明顯下降，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。由此可見(jiàn)，莫諾苷處理可減弱糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的升高。

2.5莫諾苷會(huì)抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 利用ELISA檢測(cè)SOD和MDA水平探究莫諾苷對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響。如圖6所示，I/R+DM模型組SOD水平明顯低于DM組，MDA水平則明顯高于DM組(P<0.05)。與I/R+DM模型組相比，莫諾苷處理可降低缺血再灌注誘導(dǎo)的SOD水平的下降和MDA水平的升高(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，莫諾苷會(huì)抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

圖3 HE染色檢測(cè)心肌組織病變Fig.3 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining

圖4 蛋白印跡檢測(cè)心肌損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of myocardial injury marker proteins was detected by Western blotNote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

圖5 ELISA檢測(cè)炎癥因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

圖6 ELISA檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)Fig.6 Indexes of oxidative stress were tested by ELISANote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

圖7 蛋白印跡檢測(cè)AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of AMPK pathway related proteins was detected by Western blotNote:*.P<0.05 vs DM group；#.P<0.05 vs DM+I/R.

2.6莫諾苷對(duì)AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為進(jìn)一步分析莫諾苷保護(hù)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷的分子機(jī)制，蛋白印跡檢測(cè)AMPK通路相關(guān)蛋白AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達(dá)。圖7顯示，I/R+DM模型組AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達(dá)水平明顯低于DM組(P<0.05)。加藥組AMPKα1、PGC-1α和GLUT4蛋白水平明顯高于I/R+DM模型組。由此可見(jiàn)，莫諾苷可降低缺糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達(dá)的增強(qiáng)。

3 討論

目前，糖尿病心血管并發(fā)癥的傳統(tǒng)治療藥物如抗糖尿病藥劑，以及細(xì)胞和線粒體脂肪酸吸收抑制劑等主要功效在于保持心臟代謝平衡，但還不能改善糖尿病心肌病其他的癥狀[5]。許多植物天然產(chǎn)物由于其多方面的生物活性而受到越來(lái)越多的關(guān)注。

心臟功能障礙是糖尿病大鼠心肌損傷的主要病征之一。多種天然產(chǎn)物具有提高心臟功能的作用。Diao等[6]發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠缺血再灌注模型中，落新婦苷處理可提高LVSP水平，降低心肌梗死面積，改善心肌損傷組織病理學(xué)變化。據(jù)報(bào)道在糖尿病大鼠中，綠茶的主要活性物質(zhì)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可抑制缺血再灌注導(dǎo)致的LVSP水平的降低，減少心肌梗死面積[7]。有數(shù)據(jù)顯示莫諾苷具有改善糖尿病大鼠肝臟組織病變的作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在局灶性腦缺血再灌注大鼠模型中，莫諾苷可降低腦梗死面積[9]。本文結(jié)果顯示，莫諾苷會(huì)抑制糖尿病大鼠缺血再灌注導(dǎo)致的MAP、HR和LVSP水平的降低和心肌梗死面積的增大，提高心臟功能，改善心肌組織病變。

大量研究表明許多天然植物提取物可抑制心肌損傷標(biāo)記物的釋放。有數(shù)據(jù)表明在糖尿病大鼠中，山柰黃酮醇可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的CK-MB水平的增加[10]。有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠缺血再灌注模型中沒(méi)食子酸具有降低CK-MB和cTn I水平的功效[11]。據(jù)報(bào)道在糖尿病大鼠中，淫羊藿苷可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌受損，抑制CK-MB活性的增強(qiáng)[12]。Suchal等[13]發(fā)現(xiàn)在糖尿病缺血再灌注大鼠模型中，芒果苷可抑制CK-MB活性的增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，莫諾苷會(huì)減弱糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的Mb、CK-MB和cTn I表達(dá)的上升。

炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)是各類疾病的普遍現(xiàn)象，越來(lái)越多的研究表明多種植物提取物具有抗炎的作用。有數(shù)據(jù)顯示毛地黃黃酮會(huì)減少糖尿病大鼠缺血再灌注導(dǎo)致的TNF-α和 IL-6的釋放[14]。Duan等[15]發(fā)現(xiàn)竹節(jié)人參皂甙Ⅳa會(huì)減弱糖尿病大鼠缺血再灌注引起TNF-α和 IL-6水平的升高。據(jù)報(bào)道莫諾苷可降低糖尿病大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)莫諾苷可抑制大腦局部缺血大鼠IL-1β的釋放，減輕血腦屏障損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[17]。本文結(jié)果顯示，在糖尿病大鼠中，莫諾苷會(huì)抑制缺血再灌注引發(fā)的TNF-α和 IL-6水平的上升及IL-10水平的下降。

氧化應(yīng)激是許多疾病的主要特征之一，許多植物提取物具有降低氧化應(yīng)激的功效。Silawat等[18]發(fā)現(xiàn)訶子次酸會(huì)減弱糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的MDA水平的升高和SOD活性的降低。據(jù)報(bào)道毛地黃黃酮可抑制糖尿病大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心臟MDA水平的上升[19]。有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1會(huì)減弱糖尿病大鼠中缺血再灌注引發(fā)的MDA水平的升高和SOD活性的下降[20]。有研究表明莫諾苷可降低糖尿病大鼠MDA水平，增強(qiáng)SOD活性[21]。據(jù)報(bào)道莫諾苷會(huì)抑制局灶性腦缺血導(dǎo)致MDA水平的上升和SOD活性的降低[22]。本研究結(jié)果表明，在糖尿病缺血再灌注大鼠中，莫諾苷可提高SOD活性，降低MDA水平。

AMPK/PGC-1α/GLU4信號(hào)通路在糖尿病性心肌病中起著重要的調(diào)控作用[23]。有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于太白楤木的總皂苷可通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路改善缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷[24]。有數(shù)據(jù)表明在糖尿病大鼠中，紫鉚黃酮可增強(qiáng)AMPK表達(dá)，通過(guò)AMPK通路減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[25]。據(jù)報(bào)道姜黃素衍生物B06可降低高脂飲食大鼠和糖尿病大鼠AMPKα的表達(dá)，通過(guò)AMPK信號(hào)通路改善糖尿病心肌損傷[26]。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過(guò)激活A(yù)MPK降低糖尿病大鼠缺血再灌注引起的心臟功能受損程度。本文結(jié)果顯示，莫諾苷可抑制AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達(dá)的增強(qiáng)，改善糖尿病缺血再灌注大鼠心肌損傷。

本研究表明，在糖尿病缺血再灌注大鼠中，莫諾苷可提高M(jìn)AP、HR和LVSP水平；降低心肌梗死面積；改善心肌組織病變；減弱Mb、CK-MB和cTn I表達(dá)；抑制TNF-α和 IL-6水平的上升及IL-10水平的下降；提高SOD活性，降低MDA水平；增強(qiáng)AMPKα1、PGC-1α和GLUT4表達(dá)。綜上所述，莫諾苷可通過(guò)激活A(yù)MPKα/PGC-1α/GLUT4通路減輕糖尿病大鼠缺血再灌注心肌損傷。下一步計(jì)劃研究莫諾苷對(duì)其他糖尿病并發(fā)癥的影響，為開發(fā)糖尿病并發(fā)癥治療策略奠定基礎(chǔ)。