母嬰ABO合并Rh-ccdee/ccDEe血型不合HDN實(shí)驗(yàn)診斷與鑒別診斷的研究

卞玉鳳 楚芙蕾 蘇烏德 阿依克麗木 鄭琉琪 余忠清

(新疆博州人民醫(yī)院輸血科，博樂(lè) 833400)

新生兒溶血病(Hemolytic disease of new born，HDN)是指母嬰ABO血型和Rh血型不合，導(dǎo)致母體血液中產(chǎn)生了高效價(jià)的IgG類抗體。IgG類抗體可通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒血液循環(huán)并引起胎兒或新生兒同種免疫性溶血性貧血、黃疸、水腫、肝脾腫大。嚴(yán)重者甚至形成膽紅素性腦病，又稱核黃疸而影響胎兒或新生兒大腦基底核、視丘下核、蒼白球等部位病變，導(dǎo)致胎兒或新生兒智力低下或智障[1]。在我國(guó)人群中，ABO-HDN占85%，Rh-HDN占14.9%[2]，其他血型系統(tǒng)HDN僅占0.1%。近來(lái)我科在進(jìn)行HDN實(shí)驗(yàn)診斷時(shí)，相繼發(fā)現(xiàn)2例新疆維吾爾族女同胞母嬰血型不合者。其中：例1為ABO血型不合合并Rh兩座位2位點(diǎn)表型不合，例2為母嬰A型同型，但Rh-ccdee與 Rh-CcDEe 兩座位3位點(diǎn)表型不合的特殊病例，在既往的文獻(xiàn)中查詢，未見該病例報(bào)道。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)診斷與鑒別診斷確診，及時(shí)為臨床早期預(yù)防和治療提供了依據(jù)，現(xiàn)總結(jié)并報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 例1：母，32歲，維吾爾族，新疆博樂(lè)市郊牧民。既往有妊娠史2次，2008年生產(chǎn)1次，2016年生產(chǎn)第2次、但新生兒出生1周后發(fā)生“HDN”而死亡。第3胎產(chǎn)1男性活嬰，出生后出現(xiàn)黃疸，且1 d后黃疸逐漸加重，臨床依據(jù)孕婦既往妊娠史和嬰兒現(xiàn)病史作HDN相關(guān)檢查與治療。例2：母，25歲，維吾爾族，新疆精河縣人。既往有妊娠史，人工流產(chǎn)2次，現(xiàn)孕3產(chǎn)1，待產(chǎn)入院。入院前該孕婦既沒(méi)做孕檢，也沒(méi)做產(chǎn)前檢查。入院2 d后自然分娩1女性活嬰，新生兒出生后發(fā)生黃疸，全身皮膚黃染且進(jìn)行性加重，并作HDN實(shí)驗(yàn)室檢查治療。

1.1.2試劑 ①ABO單克隆抗A/B和抗體篩選細(xì)胞均由上海市血液中心提供；Rh分型系列，由Sigma公司提供。②微柱凝膠血型卡和不規(guī)則抗體配套篩選卡均由美國(guó)強(qiáng)生公司中國(guó)上海分公司代理商提供。③試劑細(xì)胞A-c、B-c和O-c由新疆博州人民醫(yī)院輸血科血型鑒定室信息庫(kù)查詢，選擇既往RhD陰性患者抽血，重復(fù)檢測(cè)并確認(rèn)。④Rh單特異性組合譜細(xì)胞：O型Rh-CCDee(Ⅱ號(hào)細(xì)胞，批號(hào)：20177036)由上海市血液中心抗篩譜細(xì)胞中挑選；A型 Rh-CCdee(批號(hào)：17176330)、O型Rh-ccdEe(批號(hào)：17205351)由武漢市血液中心輸血研究所血型參比室提供，A型Rh-CcDEe為例2新生兒紅細(xì)胞(由本室鑒定配制)。

1.1.3儀器 全自動(dòng)血型分析儀：Ortho AutoVue?Innova，由美國(guó)強(qiáng)生公司引進(jìn)。

1.2方法

1.2.1ABO/Rh血型鑒定 采用全自動(dòng)血型分析儀自動(dòng)加樣、檢測(cè)、掃描并判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2Rh分型 鹽水介質(zhì)試管法。

1.2.3直接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn) 微柱凝膠法[3]，新生兒紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次后，配成1%的紅細(xì)胞懸液，加50 μl置微柱凝膠孔中，封口，2 000 r/min 離心10 min觀察結(jié)果。

1.2.4游離實(shí)驗(yàn)(微柱法[3]) 取微柱凝膠卡1張，標(biāo)明A、 B 、O(游離抗體)字樣和新生兒信息及檢測(cè)日期，將患兒分離血清取25 μl分別加入各孔中，再對(duì)應(yīng)加入2%試劑紅細(xì)胞懸液25 μl于各孔中，混勻，置37℃專用恒溫箱孵育15 min。取出檢測(cè)卡，對(duì)稱平衡，離心10 min觀察結(jié)果。

1.2.5放散實(shí)驗(yàn) 取生理鹽水洗滌3次后的壓積紅細(xì)胞0.8 ml左右，加等量的生理鹽水，于56℃水浴箱中手搖振蕩放散抗體。放散振蕩頻率30次/min，放散6～8 min，4 000 r/min離心1 min，立即將放散液取出置另一潔凈的玻璃試管中備用。取微柱凝膠卡1張，標(biāo)明A、 B 、O(放散抗體)字樣和患兒信息，將放散液25 μl分別加入各孔中，下同1.2.4游離試驗(yàn)操作步驟。

1.2.6抗體性質(zhì)測(cè)定及確認(rèn) 鹽水介質(zhì)試管法和微柱凝膠法。用嬰兒2 A型Rh-CcDEe紅細(xì)胞與其母抗凝血漿反應(yīng)，肉眼觀察試管及微柱凝膠卡中紅細(xì)胞的凝集強(qiáng)度。當(dāng)試管中紅細(xì)胞發(fā)生凝集時(shí)表明有IgM抗體，并用Rh組合譜細(xì)胞鑒定抗體的種類，同時(shí)用對(duì)應(yīng)的Rh譜細(xì)胞將IgM抗體吸收后再監(jiān)測(cè)IgG抗體并確認(rèn)。

1.2.7HDN實(shí)驗(yàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]①母嬰ABO/Rh血型不合；②DAT陽(yáng)性；③抗體放散陽(yáng)性；④嬰兒伴高膽紅素血癥。

2 結(jié)果

2.1母嬰 ABO/Rh血型及不規(guī)則抗體鑒定 結(jié)果見表1。

2.2母抗體特異性鑒定 母1鑒定為IgG抗A合并IgG抗D，IgG抗E缺失；母2鑒定為IgM合并IgG類抗體，IgM為抗E、IgG為抗D，IgG抗E/抗C和IgM抗C缺失。結(jié)果見表2及圖1A、B。

表1ABO/Rh血型和不規(guī)則抗體鑒定

Tab.1IdentificationofABO/Rhbloodtypeandirregularantibody

MonitoringprojectMother1Newborn1Mother2Newborn2ABO/RhbloodtypeO/Rh?ccdeeA/Rh?ccDEeA/Rh?ccdeeA/Rh?CcDEeAntibodyscreening4+4+4++AntibodypropertiesIgGIgGIgGandIgMIgG

表2抗體特異性鑒定

Tab.2Specificidentificationofantibodies

PregnantwomanA-cO/Rh?CCDeeO/Rh?ccdEeA/Rh?CCdeeConclusionMother1plasma++-0IgGanti?AplusIgGanti?D(IgGanti?Edificiency)Mother2plasma0++-IgGanti?DplusIgME(IgGanti?E/anti?CandIgManti?Cdificiency)

表3抗體效價(jià)測(cè)定

Tab.3Antibodytiterdetermination

PregnantwomanIgGanti?AIgGanti?DIgGanti?EIgManti?EIgGanti?CIgManti?CMother1plasma256128-000Mother2plasma0128-64--

表4ABO和Rh-HDN實(shí)驗(yàn)診斷

Tab.4ABOandRh-HDNexpreimentaldiagnosis

NewbornFreetestAcBcOcDATSecondantibodyDispersiontestAcBcOcExperimentaldiagnosisWaitingfordischargeBaby14+4+4+4+4+4+4+ABOincorporatesRh?HDN？Babygirl2+++4+4+4+4+Rh?HDN(mixedtypeofRhantibody？)

Note： Boys 1 Ac,Bc and Oc were all agglutination(+),The ABO plus Rh D HDN,and must be differential diagnosis.

表5ABO和Rh-HDN鑒別診斷

Tab.5ABOandRh-HDNdifferentialdiagnosis

NewbornFreetestA-1cB-cO-cDispersiontestA-1cB-cO-cRhantibodyspecificityA/Rh?CCdeeO/Rh?ccdEeO/Rh?CCDeeDifferentialdiagnosisBaby1±±-4+2+-000ABOplusRh?HDNBabygirl2000000--4+Rh?HDN(Anti?Eand?Cdeficiency)

Note：The B-c(±) and (2+) agglutination in free and dispersion tests are caused by the anti(A+B) complex antibody.

圖1 抗體特征與特異性鑒定Fig.1 Antibody characteristics and specificity identificationNote:Tube 1(Brine method):Mother 2 anticoagulation plasma and infant 2 A/Rh-CcDEe erythrocyte immune response(+);Tube 2(Brine method):Maternal 2 anticoagulant plasma and O-type Rh-ccdEe spectrum cells had an immune response(+).

2.3母抗體效價(jià)監(jiān)測(cè) 結(jié)果見表3。

2.4嬰兒ABO及Rh-HDN實(shí)驗(yàn)診斷 結(jié)果見表4。

2.5ABO及Rh-HDN鑒別診斷 用A-c、B-c和O-c陰性紅細(xì)胞，鑒別放散液中對(duì)應(yīng)的抗體；用A型Rh-CCdee、O型Rh-ccdEe和O型Rh-CCDee組合譜細(xì)胞鑒別放散液中特異性IgG抗體，結(jié)果見表5。

3 討論

人類共有30個(gè)血型系統(tǒng)，與HDN相關(guān)的血型系統(tǒng)，包括ABO、Rh、MNSs、Kidd、Kell、Diego和dufyy等。其中ABO血型不合HDN在臨床上最常見，Rh-HDN次之，其他血型系統(tǒng)HDN較為罕見。ABO HDN一般發(fā)生在母親為O型，胎兒或新生兒為A或B型者，也可發(fā)生在母親為A或B型而胎兒或新生兒為B或A型及AB型中[4]。當(dāng)母體IgG抗A(B)效價(jià)>64時(shí)，胎兒紅細(xì)胞可能發(fā)生損傷或破壞。當(dāng)IgG抗A/B效價(jià)>256且持續(xù)升高者，胎兒可發(fā)生較重的HDN[5]。

Rh-HDN在我國(guó)人群中少見，但在新疆維吾爾族人群中多見。Rh溶血癥狀較ABO-HDN重，且實(shí)驗(yàn)診斷較為復(fù)雜，尤其是多位點(diǎn)表型不合的HDN實(shí)驗(yàn)診斷與鑒別診斷難度較大。Rh組合譜細(xì)胞尋找也很困難。Rh血型系統(tǒng)有抗原5種，在Rh座位上分別由2個(gè)高度同源緊密連鎖的結(jié)構(gòu)基因RhD和RhCE串聯(lián)排列組成[6]。RhD基因編碼D抗原，RhCE基因編碼C、c、E、e 4種抗原[7]，其抗原性依次為D>E>c>C>e[8]。RhD座位有2種表型，RhCE座位有CE、Ce、cE和ce 4種表型，共組成8種單倍體遺傳給子代。當(dāng)母嬰Rh多位點(diǎn)表型不合時(shí)，母體易產(chǎn)生多種Rh類抗體。Rh抗體包括抗D、抗E、抗C、抗c、抗e[9]，在既往文獻(xiàn)報(bào)道中還有復(fù)合抗cE等4種復(fù)合抗體引起HDN[9-11]。其中以抗D抗體最多，抗E次之，抗c、抗C、抗cE及其他復(fù)合抗體較為少見。當(dāng)母體血液中Rh類抗體效價(jià)≥1∶16時(shí)，胎兒或新生兒可引發(fā)Rh血型不合的新生兒溶血病。故母嬰血型不合是高危妊娠的一種，可引起早期習(xí)慣性流產(chǎn)，早產(chǎn)或中晚期死胎[12]。

在本文研究中，我們偶遇1例母嬰O-A血型不合重疊Rh-ccdee/ccDEe兩座位2位點(diǎn)表型不合者，用O型Rh-CCDee和O型Rh-ccdEe組合譜細(xì)胞對(duì)母1抗體特異性鑒定，我們發(fā)現(xiàn)母1血清與O型Rh-CCDee細(xì)胞(微柱法)發(fā)生凝集反應(yīng)(4+)、與O型Rh-ccdEe細(xì)胞則不發(fā)生凝集反應(yīng)(-)。表明母1不規(guī)則抗體中有IgG抗D而無(wú)IgG抗E。由于母嬰1 ABO血型也不合，故我們又用A-c陰性細(xì)胞對(duì)母1進(jìn)行了抗體的定性與效價(jià)監(jiān)測(cè)，結(jié)果母1有IgG抗A產(chǎn)生，其效價(jià)為256，IgG抗D效價(jià)為128，見表1～3。由此可知：母1 IgG抗A合并了IgG抗D。隨后對(duì)嬰兒1 HDN實(shí)驗(yàn)診斷，游離A1c/Bc/Oc均為強(qiáng)陽(yáng)性(4+)、直接抗人球蛋白試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性(4+)、放散Ac/Bc/Oc也均為強(qiáng)陽(yáng)性(4+)。由此可知：嬰兒1有ABO合并Rh-HDN可能，但須經(jīng)A-c/B-c/O-c細(xì)胞鑒別診斷才能得出準(zhǔn)確的結(jié)論，見表4。我們從Rh信息庫(kù)中篩查，獲取了A-c/B-c/O-c細(xì)胞，并對(duì)嬰兒1進(jìn)行了鑒別診斷。在游離試驗(yàn)中A-1c/B-c細(xì)胞均為弱陽(yáng)性反應(yīng)(±)，但O-c為陰性反應(yīng)(-)；在放散實(shí)驗(yàn)中：A-c/B-c均為強(qiáng)陽(yáng)性(4+/2+)，O-c也為陰性反應(yīng)(-)。由此可以鑒別診斷：嬰兒1為ABO合并Rh-HDN(抗A及抗D交叉混合型)，與其母抗體鑒定結(jié)果完全相符，見表4、5。ABO合并Rh-HDN，有文獻(xiàn)報(bào)道[13]胎兒ABO血型與母體不合時(shí)，可以減少Rh-HDN的發(fā)生。這是由于胎兒紅細(xì)胞進(jìn)入母體血循環(huán)后，因?yàn)镽h血型不合受到孕婦體內(nèi)抗A、抗B的破壞，從而減少了Rh抗原的免疫作用。在本文研究中，母1為孕3產(chǎn)2，在既往第2次妊娠第1次分娩時(shí)，嬰兒出生1周后發(fā)生“HDN”死亡，這可能與高效價(jià)的Rh抗D重疊ABO抗A交叉合并溶血相關(guān)聯(lián)。對(duì)此，我們認(rèn)為：盡管ABO合并Rh可能會(huì)減少Rh抗原的免疫作用，但胎兒紅細(xì)胞一旦進(jìn)入母體血流時(shí)，記憶性B淋巴細(xì)胞在瞬間識(shí)別且同時(shí)釋放Rh抗體的免疫效應(yīng)和溶解紅細(xì)胞膜碎片刺激母體產(chǎn)生抗體的風(fēng)險(xiǎn)依然存在，其抗D含量或效價(jià)不能低估。通過(guò)對(duì)母1第3次妊娠第2次分娩時(shí)抗體監(jiān)測(cè)，其抗A效價(jià)為256，抗D效價(jià)128，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道存在一定的差異[13]。因此，我們認(rèn)為：母嬰ABO合并Rh血型不合時(shí)有可能加重HDN的臨床癥狀。鑒于母1既往發(fā)生“HDN”而死亡，故臨床采用O型RhD陰性紅細(xì)胞對(duì)新生兒進(jìn)行了換血治療，同時(shí)結(jié)合藍(lán)光照射對(duì)癥治療，嬰兒1救治及時(shí)而成活，至今生長(zhǎng)發(fā)育良好。

對(duì)母2的監(jiān)測(cè)，母嬰Rh-ccdee與Rh-CcDEe 2座位3位點(diǎn)表型不合，且母2孕3 產(chǎn)1，究竟能產(chǎn)生那些抗體？抗體性質(zhì)如何？在既往的文獻(xiàn)中查詢未見類似報(bào)道。從母嬰2 Rh分型及抗體的產(chǎn)生規(guī)律來(lái)看，該孕婦可產(chǎn)生IgG抗D、抗E、抗C，甚至抗CE等混合性抗體。這些IgG抗體分子均可進(jìn)入胎兒血液循環(huán)同時(shí)吸附在胎兒紅細(xì)胞膜上，并可加重Rh-HDN的臨床癥狀(抗體混合型)。由于試驗(yàn)中母2抗篩(4+)，嬰兒2抗篩(+)，故我們將母2 A型血漿(清)用鹽水法與嬰兒2 A型Rh-CcDEe紅細(xì)胞反應(yīng)，經(jīng)試管法離心后發(fā)現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象(+)，見圖1A。由此證實(shí)：母2血清中存在IgM類抗體。我們又用單特異性O(shè)型Rh-ccdEe、A型Rh-CCdee組合細(xì)胞分別與其母血清反應(yīng)，結(jié)果 O型Rh-ccdEe發(fā)生凝集反應(yīng)(+)、A型Rh-CCdee則無(wú)凝集反應(yīng)(-)，見表2及圖1。由此可以判斷母2 IgM為抗E、IgM抗C缺失。IgM抗C缺失可能與CE座位E的免疫原性強(qiáng)于C相關(guān)聯(lián)，即E抗原掩蓋了C抗原的免疫作用；繼續(xù)用O型Rh-ccdEe細(xì)胞將母2 IgM抗E在室溫條件下吸收10 min后，再離心取上清液分別與O型Rh-ccdEe、A型Rh-CCdee、O型Rh-CCDee譜細(xì)胞用微柱法監(jiān)測(cè)母2血漿中IgG抗E、 IgG抗C和IgG抗D。結(jié)果顯示：母2 IgG抗E和IgG抗C均為陰性(-)，與“RhD陰性人群在隨機(jī)輸血(或妊娠)水平上C抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的IgG抗體可能性最大”存在差異[14]、IgG抗D為陽(yáng)性(+),其效價(jià)為128，IgM抗E效價(jià)64，結(jié)果見表2、3。故母2血液中僅有IgM抗E合并IgG抗D(抗體混合型)。由于IgM抗E僅存于母體血液中，對(duì)胎兒來(lái)說(shuō)這又可減輕Rh-HDN的臨床癥狀，但CE復(fù)合體免疫其母產(chǎn)生IgM抗E的分子機(jī)制目前還不夠清楚，文獻(xiàn)也未見報(bào)道，尚需我們今后進(jìn)一步探討與研究。通過(guò)對(duì)嬰兒2對(duì)比監(jiān)測(cè)，嬰兒2游離抗體均為陽(yáng)性(+)，直接抗人球蛋白試驗(yàn)和放散試驗(yàn)均為強(qiáng)陽(yáng)性(4+)，因此，嬰兒2 Rh-HDN成立。但嬰兒2血液中究竟有沒(méi)有混合性抗體合并存在？我們又用A型Rh-CCdee、O型Rh-ccdEe、O型Rh-CCDee組合譜細(xì)胞分別與其放散液用微柱法作鑒別診斷，結(jié)果顯示：A型Rh-CCdee和O型Rh-ccdEe細(xì)胞與放散液均不發(fā)生凝集反應(yīng)(-)、僅與O型Rh-CCDee發(fā)生凝集反應(yīng)(4+)，監(jiān)測(cè)結(jié)果表明：嬰兒2放散液中僅有IgG抗D存在，而無(wú)IgG抗E及抗C，監(jiān)測(cè)結(jié)果與母2相符合，結(jié)果見表4、5。據(jù)此，我們可以得出鑒別診斷結(jié)論：嬰兒2為Rh抗D-HDN(單一型)。由于嬰兒2黃疸指數(shù)<342 μmol/L，故臨床采用藍(lán)光照射和肝酶誘導(dǎo)劑治療，黃疸指數(shù)逐漸下降，住院15 d后痊愈出院，治療效果良好。

總之，母嬰ABO合并Rh-ccdee/ccDEe兩座位2位點(diǎn)表型不合和Rh-ccdee/CcDEe兩座位3位點(diǎn)表型不合HDN的實(shí)驗(yàn)診斷與鑒別診斷較為復(fù)雜，臨床也未見報(bào)道。因此，我們認(rèn)為對(duì)于ABO血型不合合并Rh表型不合的HDN，必須用A-c/B-c/O-c 3種陰性紅細(xì)胞和Rh組合譜細(xì)胞加以鑒別診斷，才能較好的完成母嬰ABO合并Rh的鑒別檢驗(yàn)程序；對(duì)于Rh兩座位3位點(diǎn)表型不合的HDN，同樣需要多個(gè)Rh組合譜細(xì)胞鑒別診斷，方能區(qū)分母嬰Rh類抗體性質(zhì)和混合型抗體種類以及抗體的含量對(duì)Rh-HDN的嚴(yán)重程度，為臨床HDN早期診斷、精準(zhǔn)治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而進(jìn)一步提升我國(guó)優(yōu)生優(yōu)育的綜合診療水平。