IL-38通過(guò)上調(diào)CXCL1及IL-8募集中性粒細(xì)胞促進(jìn)轉(zhuǎn)移病灶的形成研究

岳 曼 朱 磊 李 軍

(武漢市中心醫(yī)院腫瘤Ⅱ病區(qū)，武漢 430025)

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，是引起癌癥患者死亡的首要因素[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生涉及腫瘤細(xì)胞及其所處微環(huán)境中復(fù)雜的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的激活及相互作用介導(dǎo)了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和在血液/淋巴循環(huán)系統(tǒng)中的存活，以及在轉(zhuǎn)移靶部位的生長(zhǎng)過(guò)程[2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多因素調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究將有助于深入了解轉(zhuǎn)移過(guò)程，并尋找有意義的治療靶標(biāo)，為臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)[3]。趨化因子CXCL1(C-X-C motif chemokine ligand 1)又稱為黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)性癌基因α，是一類(lèi)與細(xì)胞相關(guān)的ELR+(吸引中性粒細(xì)胞及誘導(dǎo)血管新生)CXC族趨化因子[4]。研究表明，CXCL1可結(jié)合并激活CXC趨化因子受體2(CXCR2)，活化PI3K信號(hào)通路，從而介導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化(Epithelial-mesenchy-mal transition,EMT)的發(fā)生[5]。報(bào)道指出，CXCL1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6,7]。人IL-8屬于趨化因子CXC(α)亞家族成員，又稱CXC趨化因子8[8]。IL-8的細(xì)胞來(lái)源廣泛，生理或病理的多種細(xì)胞刺激均可以引發(fā)細(xì)胞表達(dá)IL-8。研究指出，IL-8在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，阻斷IL-8或其受體不但可減輕炎癥反應(yīng)，而且可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9,10]。IL-38是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能尚未十分明確。IL-38是IL-36的部分受體拮抗劑，可作為IL-36的特異性受體[11]。報(bào)道指出，IL-38可抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和IL-22等炎癥介質(zhì)，也可抑制IL-36γ誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用[11]。據(jù)作者所知，目前尚無(wú)報(bào)道研究IL-38與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)。本次研究的目的是分析腫瘤患者腫瘤組織中IL-38的表達(dá)水平，并探討其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶形成的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1資料來(lái)源 本次研究共納入2009年1月～2014年12月我院收治的32例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及62例原位癌患者作為研究對(duì)象；所有患者中男性41例，女性53例；患者的年齡27～72歲，平均(47.3±12.6)歲。所有患者的原發(fā)病灶均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者均未經(jīng)任何治療。轉(zhuǎn)移性腫瘤患者均為肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶經(jīng)胸部X線片、CT或MRI證實(shí)。所有肺轉(zhuǎn)移性腫瘤患者均為原發(fā)腫瘤與肺轉(zhuǎn)移瘤同期發(fā)現(xiàn)患者。單個(gè)轉(zhuǎn)移病灶5例、多發(fā)轉(zhuǎn)移灶27例。單發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤23例，腫瘤平均直徑(3.2±2.7)cm；雙發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤9例，腫瘤平均直徑(2.5±1.7)cm。肺轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中，原發(fā)腫瘤為癌的患者共24例，其中結(jié)、直腸癌12例，腎癌6例，賁門(mén)癌3例，絨癌3例；原發(fā)腫瘤為肉瘤的患者共8例，其中纖維肉瘤5例，滑膜肉瘤3例。排除臨床資料不完整的患者；排除近期及長(zhǎng)期服用影響機(jī)體免疫藥物的患者；排除長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良患者；排除長(zhǎng)期臥床患者；排除伴有全身其他器官器質(zhì)性疾病患者。另選取43例同期在我院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人員作為對(duì)照；對(duì)照組患者中男性19例，女性24例；患者年齡19～78歲，平均(48.7±16.3)歲。納入研究的患者均告知本研究的目的及方法，所有患者均簽署知情同意書(shū)，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2材料與設(shè)備 主要試劑包括人IL-38 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems)，IL-38、CXCL1、IL-8抗體(美國(guó)Abcam公司)，p-MEK、MEK、p-ERK、ERK抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher)，SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)TaKaRa公司)，Realtime-PCR試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)，CXCL1及IL-18引物(上海生工生物工程股份有限公司)，CXCR2特異性抑制劑(美國(guó)Selleckchem公司)，IL-18BP(北京中美生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)，C57小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，B16F1及B16F0細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。主要設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、Tecan酶標(biāo)儀、Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)

1.2方法

1.2.1小鼠模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F1與B16F0細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，加PBS重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107ml-1。經(jīng)小鼠尾靜脈注射1×106個(gè)細(xì)胞/只，建立B16F1與B16F0細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建與小鼠分組 構(gòu)建pCMV-IL-38及pCMV-GFP質(zhì)粒。用20 μl OPTIMEN培養(yǎng)基稀釋1 μl LipofectamineTM2000脂質(zhì)體。分別用50 μl OPTIMEN培養(yǎng)基稀釋1 μg pCMV-IL-38和pCMV-GFP質(zhì)粒。將質(zhì)粒與脂質(zhì)體按1∶2.5的比例混合，室溫放置20 min，待用。分別將B16F1和B16F0肺轉(zhuǎn)移小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，前兩組小鼠分別肝臟轉(zhuǎn)染pCMV-IL-38和pCMV-GFP質(zhì)粒，將制備好的轉(zhuǎn)染液進(jìn)行肝靜脈注射轉(zhuǎn)染，第三組在轉(zhuǎn)染pCMV-IL-38質(zhì)粒的基礎(chǔ)上尾靜脈注射CXCL1抑制劑(CXCR2特異性抑制劑)和IL-18抑制劑(IL-18BP)。小鼠肝臟轉(zhuǎn)染4周后處死全部小鼠，分離肺組織，觀察轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。另取部分組織進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3免疫組化染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗 5 min×3次。采用SP法檢測(cè)COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平。即用10%正常非免疫羊血清37℃孵育60 min，滴加一抗工作液4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.2.4Real-time PCR 取小鼠肺組織進(jìn)行碾磨，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。CXCL1的上游引物序列：5′-ACTCAAGAATGGTCGCGAGG-3′，下游引物序列：5′-GTGCCATCAGAGCAGTCTGT-3′；IL-38的上游引物序列：5′-CTAGGCATCTTCGTC-CGTCC-3′，下游引物序列：5′-TTCACCCATGGAGC-ATCAGG-3′；內(nèi)參β-actin的上游引物序列：5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物序列：5′-ACGACCAGAGGCATACAGG-3′。PCR循環(huán)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5Western blot 取小鼠肺組織進(jìn)行碾磨，RIPA裂解液(含1%PMSF蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣80～120 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%BSA封閉后，加一抗4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)洗滌，加二抗(凱基生物公司)室溫孵育1 h。洗滌后，DBA顯色。

2 結(jié)果

2.1患者的基本信息 研究初期共納入41例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及67例原位癌患者，其中7例臨床資料不完整，3例近期服用影響機(jī)體免疫的藥物，2例長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良患者，1例長(zhǎng)期臥床，1例伴有其他器官器質(zhì)性疾病。最終納入研究的32例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及62例原位癌患者的基本資料如表1所示，兩組患者的年齡、性別等基本資料相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

2.2患者的血清IL-38及組織IL-38、CXCL1、IL-8水平分析 如圖1所示，ELISA結(jié)果表明，肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者的血清IL-38水平[(73.2±11.6)pg/ml]顯著高于原位癌[(46.1±10.9)pg/ml]及健康者[(15.8±3.5)pg/ml](P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者腫瘤組織中的IL-38、CXCL1及IL-8水平均顯著高于原位癌患者(P<0.05)。

表1患者基本信息對(duì)比

Tab.1CompareofbasicdataandserumIL-38levelbetweendifferentgroups

ItemsTumormetastaticgroup(n=32)Carcinomainsitugroup(n=62)tvalue(χ2value)PvalueAge47 1±13 846 3±10 90 3070 759Male[n(%)]15(46 8)26(41 9)0 2090 647Primarytumordiameter(cm)5 3±1 65 7±2 10 9440 347Primarytumortype[n(%)]Colorectalcancer12(37 5)22(35 5)0 0370 847Renalcarcinoma6(18 8)12(19 4)0 0050 944Cardiacarcinoma3(9 4)6(9 7)0 0020 962Choriocarcinoma3(9 4)7(11 3)0 0810 775Fibrosarcoma5(15 6)9(14 5)0 0200 886Synovialsarcoma3(9 4)5(8 1)0 0470 829Other0(0 0)1(1 6)0 5220 470

2.3小鼠模型的建立與分析 小鼠尾靜脈注射B16F1與B16F0細(xì)胞后所有小鼠均成功建模。肝臟轉(zhuǎn)染IL-38后，B16F1與B16F0細(xì)胞在小鼠肺部形成的轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量均顯著多于對(duì)照組(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示， IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加B16F1與B16F0肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.05)。

圖1 各組IL-38、CXCL1與IL-8表達(dá)水平分析Fig.1 Expression of IL-38,CXCL1 and IL-8 in different groupNote:A.Serum level of IL-38;B，C.IHC analysis of IL-38,CXCL1 and IL-8 level in tumor tissue.**.P<0.001.

圖2 IL-38轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠肺組織CXCL1及IL-8表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of IL-38 transfection on expression of CXCL1 and IL-8Note:A.mRNA level of CXCL1 and IL-8;B.Protein level of CXCL1 and IL-8.**.P<0.001 compared with vector transfection group.

2.4IL-38對(duì)CXCL1及IL-8的影響 Realtime-PCR結(jié)果顯示，IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加小鼠肺組織中CXCL1及IL-8的mRNA水平(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加小鼠肺組織中CXCL1及IL-8的蛋白水平(P<0.05)，如圖2所示。同時(shí)，給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38引起的小鼠肺部病灶數(shù)增加和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.05)(圖3)。

2.5IL-38對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，IL-38轉(zhuǎn)染能顯著上調(diào)肺轉(zhuǎn)移小鼠模型肺組織中CXCL1、IL-8的表達(dá)及MEK、 ERK的磷酸化水平(P<0. 05)， 且給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38對(duì)MEK、ERK磷酸化的影響(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 小鼠模型肺轉(zhuǎn)移灶及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)分析Fig.3 Analysis of metastatic foci and neutrophil infiltration in mice modelNote:A.Number of metastatic foci in different group;B.Neutrophil infiltration in different group(HE staining).**.P<0.001 compared with vector transfection group;##.P<0.001 compared with IL-38 transfection group.

圖4 IL-38轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠肺組織MEK及ERK磷酸化水平的影響Fig.4 Effect of IL-38 transfection on phospholation level of MEK and ERK

3 討論

本次研究的目的是分析腫瘤患者腫瘤組織中IL-38的表達(dá)水平，并探討其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶形成的影響。IL-38于2001年首次被發(fā)現(xiàn)，其基因位于人2號(hào)染色體上，位于編碼IL-1Ra和IL-36Ra的基因旁[12]。IL-38在免疫組織中廣泛表達(dá)，如脾、胸腺、扁桃體等[11]。IL-38能與IL-36的受體相關(guān)蛋白類(lèi)型2(IL-1Rrp2)結(jié)合。IL-38與IL-1Ra及IL-36Ra的氨基酸組成具有較高的同源性，因此推測(cè)IL-38可能作為IL-1的受體拮抗劑，其生物學(xué)功能與IL-36Ra類(lèi)似[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，IL-38對(duì)免疫細(xì)胞的生物學(xué)作用與IL-36受體拮抗劑類(lèi)似，且與一些自身免疫性疾病如強(qiáng)直性脊柱炎和關(guān)節(jié)型銀屑病有著密切的關(guān)系[11]。

本次研究中肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者的血清及腫瘤組織中的IL-38水平均顯著高于原位癌及健康者。小鼠模型的研究顯示，IL-38能促進(jìn)B16F1與B16F0肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而促使肺部轉(zhuǎn)移病灶的形成。這些結(jié)果提示IL-38在腫瘤肺轉(zhuǎn)移的生理過(guò)程中扮演重要角色。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多因素調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究將有助于深入了解轉(zhuǎn)移過(guò)程，并可以鑒定到有意義的治療靶標(biāo)，為臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)[1,2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，是引起癌癥患者死亡的首要因素，腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生涉及到腫瘤細(xì)胞及其所處的微環(huán)境中的復(fù)雜信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的激活及相互作用介導(dǎo)了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和在血液/淋巴循環(huán)系統(tǒng)中存活，以及在轉(zhuǎn)移靶部位的生長(zhǎng)過(guò)程[2]。

IL-8是一種具有趨化作用和促血管生成作用的炎性細(xì)胞因子[8,10]。研究表明，惡性腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中均出現(xiàn)IL-8及其受體表達(dá)的增加[14]。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)IL-8，從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化，并促使巨噬細(xì)胞分泌腫瘤相關(guān)生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。CXCL1最初于黑色素瘤上清液中分離獲得，通過(guò)與受體CXCR2特異性結(jié)合而發(fā)揮多種生物學(xué)功能，如血管生成、炎癥、傷口愈合以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等[5,7]。CXCL1過(guò)表達(dá)能顯著增加遷移相關(guān)蛋白(如MMP2、integrin β1等)的表達(dá)水平[16]。本次研究中，肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者腫瘤組織中CXCL1與IL-8水平均顯著高于原位癌患者；IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加小鼠肺組織中CXCL1及IL-8的mRNA與蛋白水平；給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38引起的小鼠肺部病灶數(shù)增加和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果提示CXCL1與IL-8在IL-38上調(diào)中性粒細(xì)胞促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

近期研究指出，MAPK/ERK信號(hào)通路在CXCL1與IL-8發(fā)揮促腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。本次研究中IL-38能顯著增加肺轉(zhuǎn)移小鼠模型肺組織中MEK與ERK的磷酸化水平，且給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38對(duì)MEK、ERK磷酸化的影響。

綜上所述，本次研究表明肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者的血清和腫瘤組織中IL-38、CXCL1與IL-8水平均發(fā)生顯著升高，IL-38可能通過(guò)上調(diào)CXCL1、IL-8及MEK、ERK的磷酸化水平募集中性粒細(xì)胞，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移病灶的形成。